[发明专利]泛醌类代谢中间产物的发酵生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术领域的发酵生产方法，具体是一种利用含条件性重组酶的基因工程菌株进行泛醌类代谢中间产物的发酵生产方法。

背景技术

代谢途径是生物体生存的核心，包含多个步骤。代谢途径的许多中间产物都具有巨大的研究与应用价值。一方面，它们可作为底物从分子水平上对相关的代谢酶进行结构与功能的研究，是代谢机理、代谢途径以及代谢组学的研究基础。另一方面，许多代谢中间产物本身具有重要的药用价值，如可用于消化道疾病治疗的L-谷氨酰胺和用于肝病治疗的腺苷蛋氨酸等都是代谢的中间产物。因此，对代谢中间产物的深入研究，不仅可推进相关代谢途径的功能与代谢网络研究，还可能从中分离鉴定出新的具有治疗效果的药物。

目前主要有两种方法可用于分离代谢中间产物，一是生物合成方法，另一个是化学合成方法。传统的生物合成方法是利用基因工程的方法，将目标代谢中间产物的下游分解代谢基因敲除，阻断下游代谢途径，从而在细胞内累积目标代谢中间产物。化学合成方法是在体外利用化学合成的方法，对已知结构的代谢中间产物进行合成。两种方法各有利弊，生物合成法分离较困难，产量较低，可累积的产物种类有限，但是成本较低，操作相对简单；而化学合成方法成本较高，步骤复杂，不可控因素较多，但是产量较高。因此，在对不同种类的代谢中间产物的制备与分离时会采用不同的方法。尽管如此，至今大部分代谢中间产物既不能通过简单的化学合成方法，也不能利用传统的生物合成方法进行生产，原因是这些代谢中间产物的结构复杂，化学合成困难；但其形成又涉及到生物体必需的代谢途径，无法利用传统的基因敲除策略来累积获得。

泛醌是参与生物体内电子传递、氧化磷酸化及蛋白质二硫键形成等生理过程的重要物质，对其合成代谢的研究始终是研究热点。泛醌类物质作为泛醌合成的中间产物，不仅可以用于研究泛醌及其相关代谢途径的研究，而且可用于一些疾病，如心脏类疾病的治疗，具有很高的药用价值。研究发现，在大肠杆菌中共九个酶参与从4-羟基苯甲酸起始的泛醌合成途径；其中，3-八异戊二烯-4-羟苯甲酸是整个途径中唯一的分支点。在大肠杆菌中，由UbiD和UbiX(3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸脱羧酶)两个同工酶催化其下一步代谢(Gulmezian M，Hyman KR，Marbois BN，Clarke CF，Javor GT.The role of UbiX in Escherichia coli coenzyme Qbiosynthesis.Arch Biochem Biophys.2007，467(2)：144-153)。在许多厌氧菌或者兼性厌氧菌中该酶均保守存在，说明其在泛醌合成中具有重要作用。但目前对两个酶的功能及结构报道极少，原因是该酶的底物，3-八异戊二烯-4-羟苯甲酸，很难获得。因为(1)3-八异戊二烯-4-羟苯甲酸本身结构复杂，尚无现成的化学合成技术可进行化学合成；(2)3-八异戊二烯-4-羟苯甲酸仅仅是泛醌合成途径的中间产物，体内累积量很少，无法通过常规的生物发酵法获得；(3)更重要的是，由于泛醌是细胞生长所必需的因子，直接敲除ubiD和ubiX基因的细菌无法生存，所以传统的基因改造手段也不能应用。

发明内容

本发明的目的是在于克服现有技术中的不足，提供一种泛醌类代谢中间产物的发酵生产方法。本发明利用含有条件性重组酶的基因工程菌株，可实现对必需途径中的具有复杂结构的泛醌类代谢中间产物进行生物学发酵生产，操作步骤简便，成本低廉，无有特殊的仪器要求，产量可达mg/L。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明利用同源重组技术，敲除大肠杆菌的ubiX基因，构建ubiX缺失菌株UBIX；将条件性重组酶识别序列与筛选标记基因共同插入ubiX缺失菌株的ubiD基因的两侧，构建重组菌株DYUBIF；将带有条件性重组酶的质粒导入基因工程菌株DYUBIF，获得基因工程菌株DYUBI，可用于发酵生产泛醌类中间产物——3-八异戊二烯-4-羟苯甲酸；发酵生产工程菌株DYUBI，可获得目的泛醌类中间产物——3-八异戊二烯-4-羟苯甲酸。

本发明包括如下步骤：

步骤一，利用同源重组技术，构建在目标必需基因两侧带有条件性重组酶识别位点和正负筛选标记、包含条件性重组酶质粒的基因工程菌株；

步骤二，培养上述基因工程菌株；

步骤三，加入终浓度为L-阿拉伯糖于步骤二的培养物中，诱导；

步骤四，收集步骤三的培养物，处理后进行反向HPLC检测，获得目标泛醌合成途径的中间产物——3-八异戊二烯-4-羟苯甲酸(HP8B)。