[发明专利]一种环氧化物水解酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及通过定点突变得到的环氧化物水解酶。

背景技术

环氧化物水解酶(epoxide hydrolase，EH，EC 3.3.2.3)是催化环氧化物或其盐水解为相应邻二醇或其盐的一类酶的总称，催化反应无需任何辅酶、辅基或金属离子的参与。环氧化物水解酶广泛分布于哺乳动物、植物和微生物中，目前大多数报道都集中在哺乳动物的环氧化物水解酶中，主要研究它在细胞解毒和重要生物活性物质代谢中的作用。近年来，微生物来源的环氧化物水解酶由于具有立体专一性好、酶促反应快、产物光学纯度和得率高、产物分离纯化简单易行等特点，备受人们关注。1998年Archelas等首次成功地将环氧化物水解酶应用于工业化生产，合成L(+)-酒石酸(Archelas A，Furstoss R.Epoxidehydrolase：new tools for the synthesis of fine organic chemicals.TrendsBiotechnol 1998；16：108-116)。

L(+)-酒石酸，又名(2R，3R)-2，3-二羟丁烷-1，4-二羧酸，是一种天然结构的有机酸，可用于诸如以下行业：在食品行业诸如可作为食品添加剂、增味剂以及食用色素成分之一；在医药行业诸如用于抗结核药乙胺丁醇的生产，作为不可替代的光学异构体拆分剂；在化学工业及其它工业，诸如用于印染的防染剂、照相显影剂、金属离子隐蔽剂、电镀、制革及制镜行业。

过去，生产L(+)-酒石酸的主要方法是利用葡萄酒的副产物酒石或罗望子果为原料经加工制得，或者从酒石中提取，或者以葡萄糖为主要原料通过一步发酵法提取。而通过含有环氧化物水解酶的微生物转化法是目前L(+)-酒石酸生产的发展方向，其原理如下：以顺丁烯二酸酐为原料经加水得到顺丁烯二酸溶液，再以钨酸或钨酸盐为催化剂使顺丁烯二酸与过氧化氢反应制得顺式环氧琥珀酸，最后利用微生物环氧化物水解酶将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)-酒石酸或其盐。

目前报道的能生产L(+)-酒石酸的微生物有：根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、诺卡氏菌属(Nocardia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、无色杆菌属(Achromobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)和不动杆菌属(Acinetobacter)。工业生产中常用的是具有较高酶活性的红球菌属。2007年Liu等首次报道了红球菌Rhodococcus opacusML-0004环氧化物水解酶的基因序列并在原核细胞中表达(请参见Liu ZQ，Li Y，Xu YY，Ping LF，Zheng YG.Cloning，sequencing，and expression of a novelepoxide hydrolase gene from Rhodococcus opacus in Escherichia coli andcharacterization of enzyme.Appl Microbiol Biotechnol 2007；74：99-106)。然而该酶极不稳定，对温度特别敏感，在35℃保温30min后，酶活力只有原来的60％，40℃保温30min后，活力几乎完全丧失，这极大限制了生物催化剂的使用效率。因此，如何提高酶的温度稳定性并维持高酶活性，是目前利用生物转化法生产L(+)-酒石酸急需解决的一个问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的环氧化物水解酶及其制备方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明所述的DNA分子的主体核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明所述的重组载体含有主体核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的DNA分子。

本发明所述的宿主细胞含有重组载体，所述重组载体含有主体核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的DNA分子。

本发明所述环氧化物水解酶的主体氨基酸序列的第163位的氨基酸为苯丙氨酸，所述主体氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

进一步地，本发明所述环氧化物水解酶由主体核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的DNA分子所编码。