[发明专利]一种多重基因表达的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重基因表达分析方法，特别涉及多个样本中多个基因表达的检测方法。

背景技术

随着DNA高通量测序技术的发展，以人类基因组计划为代表的一大批基因组计划相继完成，功能基因组学的研究越来越受到人们的关注。其中，功能基因组学分析的一个重要方面就是了解基因在生物体发育过程中的时空表达特征，以及在生物体发育过程中的作用。从整体出发对生物体的全部基因表达的时续性和空间性进行分析，了解基因组的功能活动和相互作用。因此，多基因表达谱分析对于阐明一系列复杂的生命科学基本问题和重大医学问题等均具有重要的意义。目前，多基因表达分析在药物靶标筛选，疾病诊断，病原物的侵染致病分子机理研究等方面均得到了广泛应用。多基因表达谱研究已逐渐成为寻找生命过程中重要基因和蛋白的最为重要手段之一。目前，主要的多基因表达谱分析方法主要有基因芯片(gene chip)，MPSS(Massive parallel signature sequencing)，SAGE(serial analysis of gene expression)和多重定量PCR(Multiplex real-time RT-PCR)等方法。

利用基因芯片(又称DNA芯片)分析基因表达开始于1995年，其基本原理是，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品cDNA杂交，杂交信号阳性的探针分子就是在组织或细胞中表达的基因，若同时将两组或多组有表达差异的组织或细胞cDNA分别与芯片杂交，芯片上信号分子的分布和强度就会有所不同，根据信号分布和强度就可以判断基因差异表达的情况。DNA microarray是非PCR技术基础的新方法，具有如下优点：①高度并行性。利用DNA芯片技术获得大量并行数据并进行分析。并行性使实验速度加快，同时芯片上代表基因的可比性加强。DNA芯片的一次反应几乎能够分析整个人的基因。②微量化。芯片技术减少了实验消耗，最小化了反应体积，但增加了样品浓度，加速了反应动力学。③多样性。芯片技术能够在一次反应中分析多个样本。新的标记和检测方法的采用，如多色荧光标记，使一块芯片能比较多个样本。这样就使得比较分析非常精确而避免了芯片间的变异造成的误差；④自动化。先进的制造技术使得芯片的制造自动化，计算机的引入使得数据的采集和分析自动化。这也是DNA microarray的最突出 特点。但是，该技术同时存在一些缺点：①价格昂贵，使用该方法的成本与其他方法相比要高的多；②需要大量的RNA，每次需50mg～200mg总RNA，对于低拷贝数的mRNA需要量更大，所以分析少量的临床标本存在困难；③需要完善的基因数据信息，无法获得未知基因，需要一系列克隆或已知基因的寡核苷酸，对于未完成测序工作的生物样本不适用该方法；④与其他方法相比，灵敏度较低，定量特性较差。

MPSS(Massive parallel signature sequencing)技术是由美国科学家Brenner等于2000年发明了一种新的基因表达分析技术。该技术是利用限制性内切酶和荧光检测知识，发展出的一种辨认和测定细胞每一个cDNA克隆片段末端16～20bp序列的方法，从而查明细胞内所有基因的表达情况。MPSS技术的主要优点是操作简便，速度快，时间短。MPSS分析系统自动化程度较高，诸如微球体阵列的制作，反应液的供排、各种反应条件的控制，图像的处理和数据的分析已经完全自动化，可同时分析数以万计的基因数目，甚至超过了SAGE的一次性分析能力(SAGE的一次性可分析上千个基因)，同时不需要耗费时间做大量的PCR实验，不需要对cDNA模板做特殊的处理，也不用对探针序列进行提前选择。更为重要的是MPSS可根据荧光信号对基因表达水平做定量的分析，能提供基因末端序列信息，这一点MPSS与RT-PCR、SAGE等常规方法不同。另外，MPSS对基因末端序列与常规测序不同的是，它不需要进行基因片段的分离、克隆再逐一测序，而是具备了DNA芯片、cDNA微阵列荧光分析法直接读出序列的优点，可同时获得大量cDNA末端序列，从而简化了测序过程，这符合后基因组时代基因功能分析的高通量、自动化、微型化的要求。当然该技术同DNA芯片技术一样，需要较为昂贵的硬件和相配套的软件的协同运做，因此目前还亟需降低仪器检测的成本，加强推广和普及工作。