[发明专利]一种多重基因表达的分析方法

权利要求书

1.一种多重基因表达的分析方法，其特征在于：首先提取总RNA，利用各个基因相对应的嵌合引物，反转录获得各个基因的cDNA混合物，所述嵌合引物由含特定酶切位点的通用引物和各基因特异引物组成；然后利用包括所述含有特定酶切位点的通用引物进行PCR扩增得到各个基因表达标签的PCR产物；通过包括酶切、连接将代表各个基因的表达标签串联到一起，再将串联子克隆到载体上进行测序、分析；所述嵌合引物中通用引物的特定酶切位点与PCR扩增出的各基因表达标签的酶切位点不相重合。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述嵌合引物的5′端为含特定酶切位点的通用引物，所述嵌合引物的3′端为各基因特异引物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含特定酶切位点的通用引物含17个以上的碱基。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述各基因特异引物含16个以上的碱基。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述含特定酶切位点的通用引物含碱基数量为18-25个。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述各基因特异引物含碱基数量为16-25个。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：利用包括所述含有特定酶切位点的通用引物进行PCR扩增具体是，先以所述反转录得到的cDNA为模板，利用各基因相对应的嵌合引物，在PCR前1-2或1-3或1-4或1-5个循环富集各个基因的表达标签；然后在以后的PCR循环中利用所述含有特定酶切位点的通用引物进行扩增。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR前面富集各个基因表达标签的循环所用嵌合引物与剩余的循环所用的通用引物的摩尔比为1∶50。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述PCR循环共为25-35个；在所述PCR前1-3个循环富集各个基因的表达标签，然后在以后的PCR循环中利用所述含有特定酶切位点的通用引物进行扩增。

10.如权利要求1所述的方法，包括如下步骤：

a.提取待分析样本的总RNA，利用各个基因相对应的嵌合引物，在同一反应管中反转录获得各个基因的cDNA混合物；所述嵌合引物由位于5′端的含有17个以上碱基的含特定酶切位点的通用引物和位于3′端的含有16个以上碱基的各基因特异引物组成；

b.利用所述的各个基因相对应的嵌合引物，以所述反转录获得的cDNA为模板，在PCR的前1-3个循环富集各个基因的表达标签，在各表达标签的末端均含有特定的限制性酶切位点；

c.在接下来的PCR的4-28个循环中，利用所述通用引物进行扩增，得到末端均含有特定的限制性酶切位点的各个基因的表达标签的PCR产物；所述PCR前1-3个循环所用嵌合引物与接下来的PCR4-28个循环所用的通用引物的摩尔比为1∶50；

d.沉淀回收所述c步骤所得的PCR产物，并利用各个表达标签末端含有的酶切位点，对所述PCR产物进行酶切，回收得到酶切产物；

e.利用连接酶将所述酶切后的PCR产物串联起来，形成串联子，电泳回收500bp以上的串联子，再将串联子连接到制备好的用相同的限制性内切酶酶切克隆载体上；

f.挑取所述多个克隆进行测序，利用Blast软件对测序结果进行分析。