[发明专利]土著益生微生物固体菌剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明主要涉及微生物的发酵方法，尤其涉及利用食品行业产生的废液废渣制备巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌三菌组合的固体菌剂的方法和应用。

背景技术：

传统的微生物菌剂的制备方法，所用原料是葡萄糖、蛋白胨、糖蜜、牛肉膏、维生素，无机盐和水配制成液体培养基，从试管斜面菌种上刮取菌苔接种在液体培养基中，经好氧或厌氧培养制备成液体菌剂或将液体菌种接种在由玉米粉、麸皮、豆面、籽饼、豆粕和米糠等原料组成的固料培养基上，发酵制备成固体菌剂。其缺点是：所用原料成本高，生产工艺复杂，不能节约能源。

混合菌剂传统做法，是将各种不同的菌种(好氧和厌氧)在各自不同的生长环境中培养菌种，然后从每个菌种的培养物中刮取菌苔制取每个菌的液体菌悬液，再转种于各自的液体培养液经通气或厌氧发酵培养后离心制取活性细胞菌，将沉淀物喷雾干燥制成粉剂，制成多菌的混合。其缺点是：制备工艺复杂，发酵周期长，成本高，应用受到限制。

发明内容：

本发明的目的在于避免现有微生物固体菌剂生产技术不足之处而提供一种土著益生微生物固体菌剂及其制备方法和应用。

使用巨大芽孢杆菌与胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌科学配伍，以新鲜豆腐或粉丝或玉米或洋芋淀粉产生的废渣及农业秸秆为原料，添加少量无机盐，培养料不灭菌，三种菌在同一条件下制备巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌固体菌剂的制备方法。该方法是利用食品行业产生的废渣为原料，生产过程无“三废”污染，生产工艺简单，操作方便，节省人力，节省能源，其固体菌剂，即可用于有机废水净化剂，又可作为微生物肥料和微生物饲料添加剂。

本发明的目的可以通过采用以下技术方案实现：一种土著益生微生物固体菌剂，其主要特点在于由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)和固体培养基组成，其三种菌株的重量百分比为巨大芽孢杆菌为55～65％、胶冻样芽孢杆菌为30～35％、圆褐固氮菌5～10％，所述的巨大芽孢杆菌的保藏号为CGMCC 3770；所述的胶冻样芽孢杆菌的保藏号为CGMCC 3769；所述的圆褐固氮菌的保藏号为CGMCC 3768。

所述的土著益生微生物固体菌剂，所述的固体培养基包括有重量百分比为以干料计50-80％的糟渣，15-30％的玉米芯粉，8-12％的麸皮，0.5-0.8％的玉米面，0.1-3％的尿素，0.2-4％的硫酸铵，再加入新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水使其含水重量百分比为45-65％，用1％的石灰水调pH 7.0-7.5。

一种土著益生微生物固体菌剂的制备方法，其主要特点在于包括有如下步骤：

A.土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：

a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至pH7.0-7.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；

b.菌种的培养：分别取巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌的一级菌种；

B.土著益生圆褐固氮菌琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：

a.琼脂斜面培养基的制备：磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.01-0.03％，氯化纳0.01-0.03％，碳酸钙0.4-0.6％，甘露醇0.8-1.2％，硫酸钙0.08-0.12％，琼脂1.8-2.2％，水80-120毫升，加热溶解，用1％的氢氧化纳调pH值6.8-7.0，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下，分装于15×1.5cm干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；

b.土著益生圆褐固氮菌菌种的培养：取土著益生圆褐固氮菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃，48-32h，即得土著益生圆褐固氮菌琼脂斜面菌种，为一级菌种；

C土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、圆褐固氮菌液体培养基的制备及液体菌种的培养：