[发明专利]一种微生物发酵过程放大平台技术

说明书

 

技术领域：

本发明涉及一种微生物发酵过程放大平台技术，该技术在发酵过程中选取标志性代谢物来反映微生物的生长状态以及发酵培养基的状况，并通过控制标志代谢物变化并结合流体力学计算设计改进搅拌反应器尺寸和结构，提高气含率，对发酵条件进行优化，并将发酵过程进行放大。

 

背景技术：

高密度发酵过程中由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用，为了解决高浓度底物抑制，分批补料发酵已经广泛地利用于各种微生物的高浓度发酵。如：日本在1992年的研究中，使用发酵菌株为抗1，2，4-三氮唑的酿酒酵母KY6186，通过在线监测发酵液中溶解氧和乙醇的体积分数，运用前馈/反馈控制系统确定葡萄糖的流加速率，使葡萄糖和乙醇同时被利用。在120吨发酵罐中，60小时发酵结束时GSH产量为2360 mg L^-1，产率为39.33 mg L^-1 h^-1，比指数流加方式提高了40%，胞内GSH质量分数达到3.7%[Sakato K, Tanaka H(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Advanced control of glutathione fermentation process（谷胱甘肽发酵过程的先进控制）. Biotechnol Bioeng. 1992 Oct 20;40(8):904-12]。武薇等采用分批补加葡萄糖，控制在20 g/L~25 g/L的方式进行马链球菌( Streptococcus equi )在发酵生产透明质酸（HA），HA的产量达到5.6 g/L，平均分子量达到1.78×106u，较分批发酵时HA产量提高90%，分子量提高46%[武薇. 透明质酸补糖分批发酵工艺研究. 食品研究与开发. 2008]。陈坚等对产朊假丝酵母高密度培养合成谷胱甘肽过程进行研究，在恒定速度(5.5 g·L-1·h-1)流加葡萄糖基础上，发酵45 h细胞干重最高达到73 g·L-1，此时向发酵罐中一次性添加L-半胱氨酸，最终GSH产量和胞内GSH含量分别达到了1458mg L-1和2.26%。[张文燕,堵国成,陈坚.流加发酵及添加L-半胱氨酸对产朊假丝酵母高密度培养合成谷胱甘肽的影响.应用与环境生物学报.2007]。You Jian Feng以酿酒酵母ZJUS1为生产菌株进行葡萄糖流加策略研究，发现为了得到较高的生物量采用指数流加策略（设定指数??为0.13），经过60小时发酵SAM、GSH和细胞干重分别达到8.77、0.81和105 g L-1[Lin Jian Ping, Tian Jun, You Jian Feng. An effective strategy for the co-production of S-adenosyl-L-methionine and glutathione by fed-batch fermentation. Biochemical Engineering Journal. 2004]。中国专利ZL200310116833.6中，公开了乙醇反馈控制流加的酵母高密度发酵方法及其应用，该方法通过浓度监测仪在线监测发酵液中的乙醇浓度，并应用于酵母细胞的高密度发酵。

此外，发酵液中溶解氧含量是影响好氧微生物高浓度发酵的另一个关键因素。尤其是在发酵过程后期，发酵液粘度很大，细胞的耗氧量又极大，发酵液中各物理参数的改变均不能对溶氧产生较大的改观，细胞生长缓慢。顾小华采用计算流体力学(CFD)技术深入研究了搅拌对菌体生长HA合成的影响，通过改变搅拌桨组合方式的手段有效地解决了物料混合时间和反应器内部剪切速率之间的矛盾，最终HA分子量提高 23.9％。[顾小华. 采用计算流体力学技术研究搅拌对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响. 生物工程学报. 2009]。目前发酵过程放大技术主要包括有：发酵罐几何相似准则放大，借鉴化学工程的因次分析法，时间常数法。单位体积功率，混合时间等参数值相似准则；准数规则放大（工业放大），根据氧传递系数、线速度等相等放大；英国尼洛教授提出的基于N-S方程计算流体力学放大和多尺度参数和计算流体力学放大（华东理工大学），即将发酵过程宏观物理学参数与生物生理特性参数如RQ 、OUR、CER等关联进行放大，其参数是包括温度、溶氧、pH、发酵尾气中CO₂和O₂的浓度变化来指导发酵过程放大，只是考虑了反应器对发酵过程的影响，未考虑微生物发酵过程分子水平代谢变化，放大仍部分依靠经验。