[发明专利]利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种构建犬2型腺病毒和疱疹病毒I型活载体重组疫苗的新方法，尤其是公开一种利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法，属于疫苗制备技术领域。

背景技术：

目前，用于遗传性疾病基因治疗和重组活载体疫苗构建的载体系统有十余种，其中DNA病毒载体在疫苗研究中最为常用，主要有腺病毒、疱疹病毒、痘病毒和杆状病毒等。

重组DNA病毒的构建策略过去主要基于同源重组原理，包括：①细胞内同源重组，即在两段基因组DNA分子之间进行重组。一旦发生同源重组，即可得到预期的重组病毒，无需纯化，但是，重组效率较低。②位点特异性同源重组，即发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶只能催化特异性位点间的重组，不能催化其它任何两条同源或非同源序列之间的重组。③细菌内同源重组，即在大肠杆菌内通过同源重组的方法构建重组病毒质粒载体，经酶切线性化后再转染病毒包装细胞系，从而得到重组病毒。与哺乳动物细胞比较，在大肠杆菌内进行挑克隆、鉴定等操作更加便利，但是，由于在大肠杆菌中病毒序列的遗传选择压力较小，发生突变导致病毒活力下降的可能性高于细胞内重组。④酶切连接，即在病毒质粒中通过连接反应插入一个表达盒，而不是进行同源重组。其优点是：质粒的构建和扩增快速，转染效率高。不足之处在于：在大肠杆菌中病毒序列的遗传选择压力较小，发生突变导致病毒活力下降的可能性要高于真核细胞内重组；单一酶切位点比较稀少，且稀有内切酶的价格昂贵。

目前，已报道的狂犬病-犬2型腺病毒活载体重组疫苗(扈荣良等，prevention ofrabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2encodingthe rabies virus glycoprotein.Microbes and Infection，2006；8(4)：1090-1097)采用的是细菌内同源重组和酶切连接方式获得重组病毒；狂犬病-疱疹病毒I型活载体重组疫苗(扈荣良等，a recombinant pseudorabies virus expressing rabies virusglycoprotein：safety and immunogenicity in dogs.Vaccine.2008；26(10)：1314-21)采用的是细胞内同源重组技术。以上重组病毒的构建方法与本发明涉及的转座机制相比，存在重组效率低或易发生突变的缺点。

转座子(Transposon)又称跳跃因子，是不必借助于同源片段，在转座酶(Transposase)的介导下便可在质粒之间或质粒与基因组之间转移位置的DNA片段。因为具有随机重组的特性，转座子已广泛应用于新基因的发现和功能研究，以及培育转基因动物等。

发明内容：

本发明公开一种利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法，具有高效、廉价和稳定的优点。

本发明的采用以下技术解决方案：

将平行表达报告基因(如：绿色荧光蛋白基因)和保护性抗原基因(如：狂犬病病毒糖蛋白基因、猪瘟E2基因)的表达盒通过常规的分子克隆手段插入带有转座子序列的穿梭载体(如：pMOD-2<MCS>)，该插入位点的两侧为转座子序列；然后，利用限制性内切酶将带有基因表达盒的转座子从穿梭载体游离，并经琼脂糖凝胶电泳纯化；再利用转座酶反应体系处理(37℃，2小时)纯化的转座子和载体病毒的全基因组，反应结束后加入终止液，并经70℃灭活10分钟；最后，利用脂质体等真核细胞转染试剂将反应物转染载体病毒的包装细胞，获得表达外源基因的重组病毒；经蚀斑克隆或有限稀释法纯化后，即可作为重组疫苗免疫动物。

本发明利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法，其特征在于：在转座酶的作用下，使携带外源基因表达盒的转座子与载体病毒的全基因组发生重组，然后将重组产物转染病毒的包装细胞，获得表达外源基因的重组病毒，经常纯化后制成重组疫苗。

所述的方法，其特征在于：利用转座子和转座酶介导的DNA重组机制，构建犬2型腺病毒和疱疹病毒I型活载体重组疫苗。

所述的方法，其特征在于：利用绿色荧光蛋白报告基因和狂犬病病毒糖蛋白保护性抗原基因、猪瘟病毒E2保护性抗原基因，在转座子和转座酶的介导作用下，将平行表达报告基因和保护性抗原基因的表达盒插入载体病毒的全基因组，并在细胞中获得表达。