[发明专利]利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法

权利要求书

1.一种利用转座子构建病毒活载体重组疫苗的方法，其特征为：在转座酶的作用下，使携带外源基因表达盒的转座子与载体病毒的全基因组发生重组，然后将重组产物转染病毒的包装细胞，获得表达外源基因的重组病毒，经常纯化后制成重组疫苗。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于：利用转座子和转座酶介导的DNA重组机制，构建犬2型腺病毒和疱疹病毒I型活载体重组疫苗。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于：利用绿色荧光蛋白报告基因和狂犬病病毒糖蛋白保护性抗原基因、猪瘟病毒E2保护性抗原基因，在转座子和转座酶的介导作用下，将平行表达报告基因和保护性抗原基因的表达盒插入载体病毒的全基因组，并在细胞中获得表达。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于：利用犬2型腺病毒和疱疹病毒I型DNA病毒，在转座子和转座酶的介导作用下，对其基因组进行改造，并获得表达外源基因的重组病毒。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于：利用犬2型腺病毒和疱疹病毒的包装细胞MDCK和Vero，将转座子与载体病毒全基因组的重组产物转染细胞，包装出重组病毒。

6.权利要求1所述的方法，包括以下步骤：

1)基因表达盒的构建

利用真核表达质粒载体pIRESneo，通过分子克隆技术构建平行表达报告基因(如：绿色荧光蛋白基因)和保护性抗原基因(如：狂犬病病毒糖蛋白基因、猪瘟E2基因)的表达盒；

2)重组转座子的构建

通过常规的酶切、连接和转化技术，将表达盒克隆至带有转座子序列的商品化穿梭载体pMOD-2<MCS>，插入位点为两段转座子序列之间的多克隆酶切位点；

3)转座酶介导的转座反应

根据转座子穿梭载体的使用说明书，将重组转座子经酶切游离和琼脂糖凝胶电泳纯化后，与载体病毒全基因组等量加入转座酶反应体系，37℃反应2小时，反应结束后加入终止液，70℃10分钟灭活转座酶活性；

4)重组病毒的包装

将转座子与载体病毒全基因组的反应物，在转染试剂的介导下，转染载体病毒的包装细胞，包装重组病毒；

5)重组病毒的纯化与鉴定

利用蚀斑克隆或有限稀释法对重组病毒进行亚克隆3～5次，获得纯化的重组病毒；利用针对外源基因的免疫学方法或Southern杂交对重组病毒进行鉴定。