[发明专利]基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体构建及应用。

背景技术

猪瘟(classical swine fever，CSF)是猪的一种高度接触性烈性传染病。虽然各国都很重视猪瘟的防制，但由于目前养猪业的集约化和生猪贸易的全球化，猪瘟对全球养猪业仍构成严重威胁。猪瘟的病原为猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)，属黄病毒科瘟病毒属成员，是有囊膜的单股正链RNA病毒。基因组长约12.3kb，两端为5′-端和3′-端非编码区，中部为编码区，包括4个结构蛋白和8个非结构蛋白，其中只有囊膜糖蛋白E2和Erns可诱导机体产生中和抗体。

在许多国家和地区，疫苗免疫仍是控制猪瘟的重要手段。目前使用的弱毒疫苗大部分是我国1954年研发的基因1型猪瘟兔化弱毒C株疫苗。在相当长时间内，由于其性能稳定、免疫效果好，被国内外公认为安全有效的弱毒疫苗。但该疫苗存在一定缺陷：疫苗免疫后诱导的抗体与动物感染野毒后产生的抗体类型相似，无法应用血清学方法快速鉴别诊断疫苗免疫和野毒感染的动物。近年来研究表明，猪瘟病毒在全球的流行形势逐步由基因1型向2型过渡，且两者的主要宿主保护性抗原E2在基因水平和抗原结构上均存在较大差异。加之数十年来在大规模免疫接种压力下，流行毒株出现抗原变异和免疫逃逸现象已经是不争的事实。同时，猪瘟疫情日益复杂，但实际监测中缺乏一套快速、灵敏、特异的鉴别检测方法。因此，研究、改造和开发适合我国流行特点的新型猪瘟弱毒疫苗以及配套的鉴别检测方法已迫在眉睫。

近年来建立的RNA病毒感染性cDNA技术，可通过DNA水平的操作实现对RNA病毒基因组的改造。应用该技术已经发现囊膜糖蛋白E2是病毒主要的毒力因子之一，且与病毒的细胞嗜性有关。浙江大学动物预防医学研究所也已成功构建了猪瘟病毒疫苗C株的感染性cDNA，为改造和开发新型猪瘟疫苗奠定了基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体构建及应用。本发明的目的是在保留疫苗C株在兔体内复制和对猪无致病力等特性的基础上，通过E2蛋白N端抗原区的置换，可改变重组病毒E2的抗原性。以此重组病毒免疫猪只后，既无致病性，又能产生针对目前2型流行毒株E2的特异性抗体。同时，在重组病毒中引入探针标记序列可应用于荧光定量PCR鉴别检测方法中。

为解决技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体的构建方法，包括步骤：

(1)以含有猪瘟病毒疫苗疫苗C株基因组5′半长的重组质粒pA-F123为模板，用限制性内切酶SpeI和NsiI进行酶切，酶切产物经割胶回收后获得纯化的pA-ΔE2-F123质粒；

(2)用BamHI和SalI将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3′半长的F456片段从重组质粒pB-F456中切下，克隆于相同酶作用的pA-ΔE2-F123中，获得重组质粒pA-ΔE2-FL22。

作为前述方法的应用，本发明还提供了一种携带标记序列的流行毒株E2基因的感染性cDNA载体的构建方法，包括步骤：

(1)用通用上游引物E2-SpeI-U：5′-GCTAACTGGGGCACAAGG-3′-和下游引物E2-NsiI-L：5′-CCCGACTTGAC-3′扩增不同流行毒株E2的830bp片段。同时，在不改变E2氨基酸序列的基础上，还应用此下游引物可将标记序列引入扩增的流行毒株E2中，分别是位于下游引物3′端的第6位核苷酸和位于下游引物3′端的第9位核苷酸。

(2)PCR产物经割胶回收后，用限制性内切酶SpeI和NsiI进行酶切，酶切产物经割胶回收后克隆于所述重组质粒pA-ΔE2-FL22，获得携带不同流行毒株E2基因的感染性cDNA载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明构建的可插入式cDNA载体，可根据该病的流行形势，快速、方便的拯救携带不同基因型E2基因的重组C株病毒；重组病毒E2基因中引入探针标记序列可应用于荧光定量PCR鉴别检测方法中。拯救的重组病毒保留C株在兔体内复制以及对自然宿主猪无致病力等特性；本方发明还可改变重组病毒主要宿主保护性抗原E2的抗原性，免疫后产生针对重组病毒E2的特异性抗体(包括特异性的中和抗体)。

附图说明

图1为基于猪瘟病毒E2基因的可插入式cDNA载体pA-ΔE2-FL22以及特异性标记序列的构建示意图。