[发明专利]一种基因工程囊素样肽及其表达基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程囊素样肽及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

囊素三肽(BSTP或BS)是Audhya T等1986年首次从鸡法氏囊中提纯的一种序列为Lys-His-Gly-NH₂的三肽，功能是诱导禽类和哺乳类的B细胞前体分化为B细胞，选择性分化激素，对体液免疫起着重要的调节作用。

目前对囊素三肽的制备方法主要有两种：一种是化学合成法，另一种是生物合成法。

化学方法由于其固有弊端，如：工艺繁琐，副产物多且去除困难等。如公开号为CN1696151的中国专利，公开了一种法氏囊素三肽合成方法，它包括：氨基酸保护、保护组氨酸-甘氨酸甲酯二肽合成、保护组氨酸-甘氨酸二肽的脱氨基保护、保护赖氨酸-组氨酸-甘氨酸的合成、保护赖氨酸-组氨酸-甘氨酸的脱氨基保护、法氏囊素三肽粗品的合成、法氏囊素三肽粗品的纯化。

生物方法合成主要方向为利用囊素三肽的表达基因导入大肠杆菌然后进行大规模生产。但目前为止，因为表达量低，尚未有能够达到工业化应用的报道。

生物方法合成产量最高的报道为：张焕玲等在江苏农业学报第2003-19-2期中名称为：法氏囊提取物中囊素三肽含量的测定的论文中提到在大肠杆菌中成功的进行了囊素三肽表达，它利用大肠杆菌所惯用的密码子，将5个BSTP基因串联与克隆载体pDuc57相连，在大肠杆菌中表达，光密度扫描表明BS含量仅占菌体总蛋白的13.4％。李萍等在中国兽医杂志第2006-42-4期中名称为：囊素三肽的基因克隆和表达的论文中提到利用了大肠杆菌所惯用的密码子，以合成的BS1、BS2为引物扩增囊素三肽串联片段(BS8)，克隆pBAD/Thio-TOPO载体，用pBAD/TOPO-Thio大肠杆菌表达系统进行表达，含BS8融合蛋白的分子量大小约为19kDa，BS8融合蛋白主要以可溶形式存在，后提取需要进行细胞破碎，镍柱进行纯化等。但是依然存在囊素三肽表达量不高，后提取工艺需要细胞破碎、纯化等步骤，成本比较高且繁琐，无法进行大规模生产的弊端。

因此研制出高表达量，后提取工艺成本低，步骤简单，适合规模化生产，高活性的三肽囊素制备方法是解决目前囊素三肽应用瓶颈的主要途径之一。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种基因工程囊素样肽及其表达基因与应用。

发明概述

经研究发现，目前对于BSTP基因进行扩增表达报道的还比较少，BSTP无法大规模生产，主要原因是因为BSTP的长度较小，仅为三个氨基酸，这样在设计引物PCR时的引物长度较小，退火温度较低，克隆出的基因片段准确性较低而且重复性较差，这也就为后来进行BSTP基因克隆和表达留下了很大的困难。本发明根据按照大肠杆菌惯用密码子设计一种BS样肽基因片段，构建pET-32a(+)表达载体，转化大肠杆菌BL21，在摇瓶中高效表达，采用非常规后提取工艺制备囊素样肽制品。

发明详述

本发明涉及：

[1]一种基因工程囊素样肽，具有如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。

本发明还涉及：

[2]一种编码[1]中基因工程囊素样肽的基因片段，具有如SEQID N0.2所示核苷酸序列。

进一步的，本发明还涉及：

[3]含有SEQID N0.2所示核苷酸序列的表达载体。

此外，本发明还涉及：

[4]根据[2]记载的基因工程囊素样肽的基因片段在制备囊素三肽中的应用。

[5]根据[4]记载的应用，步骤如下：

(1)将基因工程囊素样肽的基因片段插入表达质粒，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)制得的重组质粒转化宿主菌，构建宿主菌表达体系；

(3)利用步骤(2)构建的宿主菌表达体系诱导表达囊素样肽，并经过后处理工艺制得囊素三肽。

[6]根据[5]记载的应用，步骤(1)中所述将基因工程囊素样肽的基因片段插入表达质粒，是指用核酸限制性内切酶EcoR I及SalI、Xho I或HindIII之一双酶切基因工程囊素样肽的基因片段，连接到相同酶切的表达质粒上，然后进行测序验证。

上述核酸限制性内切酶EcoR I及SalI、Xho I或HindIII，均为现有技术产品，可通过市场购得。

[7]根据[6]记载的应用，所述表达质粒为：pET-32a、pET-32b或pET-32c。所用表达质粒均为市售产品，本领域技术人员可根据产品说明书进行操作，将基因工程囊素样肽的基因片段插入表达质粒。