[发明专利]一种腈转化酶的高通量筛选方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种腈转化酶的高通量筛选方法。

(二)背景技术

腈类化合物是重要的医药、农药和精细化工中间体。腈类物质的微生物降解有氧化、还原和水解等3种途径。后者又可以根据参与水解反应的酶系不同分成两类：一是腈水解酶(nitrilase，E.C.3.5.5.1)，直接将腈水解为羧酸和氨；另一途径是先在腈水合酶(nitrile hydratase，E.C.4.2.1.84)的作用下将腈水合生成酰胺，如果微生物中还存在酰胺酶(amidase，E.C.3.5.1.4)，则在其作用下进一步生成羧酸和氨，反应需两步完成(BiotechLett.1994，16：47-50)，如图1所示。

目前，腈水合酶(NHase)的工业化应用越来越受到人们的关注。自1980年Asano发现高NHase活力的微生物Pseudomonas chlororaphis B23，并将其成功应用于丙烯酰胺的大规模生产以来，NHase这一生物催化领域的分支得以迅速发展，其应用范围扩展至精细化工产品、医药中间体、农药中间体和化妆品等多个领域，合成的产物已经大大超过100种，包括脂肪族、环脂肪族、芳香族以及杂环族的酰胺和羧酸。

酰胺酶最早发现于1964年，分别是由Kelly和Jakoby在Pseudomonsaeruginosa和Pseudomonas fluorescens中发现的。酰胺酶的底物范围很广，能够水解各种天然及人工合成的脂肪族和芳香族酰胺。某些酰胺酶具有很好的立体选择性，在制备手性化合物方面具有巨大的潜力，正日益受到工业界的重视。

腈水解酶能够催化腈水解生成相应的羧酸和氨，1964年由哈佛大学的Thimann和Mahadevan从大麦叶子中正式分离得到，并命名为腈水解酶。它能将吲哚-3-乙腈转化为吲哚-3-乙酸。第一个能产腈水解酶的微生物菌种是由Hook和Robinson利用天然腈化合物蓖麻碱做为唯一碳源，筛选得到的假单孢菌(Pseudomonas)，该菌水解氰基吡啶的能力比蓖麻碱高1.18倍。在此之后利用腈水解酶催化腈水解生产相应羧酸的研究和应用也越来越多。

鉴于腈转化酶在工业微生物技术领域的重要性，越来越多的研究集中于产腈转化酶新菌株的筛选和现有菌株及酶的改良。从自然界的土壤、水体和污泥等环境中，通过传统方法筛选产腈转化酶菌株效率低，工作量大。另一方面，随着基因工程技术的快速发展，可供选择的生物催化剂的数量飞速增长。如通过定向(分子)进化技术，由于突变文库包含的突变体数量巨大(通常含10⁴～10⁶突变子)，对快速、准确的高通量筛选模型的建立提出了更为迫切的需求。腈水解酶和酰胺酶由于水解产物均含有氨和羧酸，因此可以通过显色或荧光检测检测氨或羧酸的生成以构建快速筛选模型。Henke等利用酶催化底物水解所产生的胺类物质，经衍生化生成容易检出的荧光染料，建立用于筛选以N-酰胺为底物的水解酶。Duchateau等建立的模型依据碱性环境下氨基酸及其相应的氨基酰胺与Cu(II)形成的复合物在光谱特性上的差异，用于筛选氨基酰胺酶。Zheng等构建了基于酰基转移反应的立体选择性酰胺酶筛选模型，用于筛选R-型酰胺酶，制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺。腈水合酶的筛选主要是以GC、HPLC或^1HNMR法检测酰胺是否生成，这些方法不仅费时费力，而且对设备要求高、通用性差。迄今为止，在国内外文献中尚无用于筛选腈水合酶的高通量快速筛选模型报道，也没有同时可以用于腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶的高通量筛选的方法报道。

(三)发明内容

为了克服传统的腈水合酶筛选模型在筛选过程中费时费力、对设备要求高、通用性差等缺点，本发明提供了一种基于络合显色反应的腈转化酶高通量筛选方法，该方法不仅可用于高通量筛选腈水合酶，而且还可用于酰胺酶和腈水解酶的快速筛选。

本发明采用的技术方案是：

一种腈转化酶的高通量筛选方法，所述腈转化酶为腈水合酶、酰胺酶或腈水解酶，所述方法包括：取待测样品溶于蒸馏水中，加入底物氨基腈类化合物或羟基腈类化合物或酰胺类化合物、至底物浓度为1～100mM，于10～50℃水浴转化反应10～120min，取转化液，先后添加Fe²⁺和Fe³⁺离子水溶液，进行显色反应，添加两种离子的时间间隔为0～10min，所加入的底物、Fe²⁺、Fe³⁺物质的量之比为1∶1～3∶1～3；