[发明专利]一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒

权利要求书

1.一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，包括：

(1)TB稀释液：为含RNase抑制剂的灭菌DEPC水溶液；

(2)TB反应液：为含dNTPs和NTPs扩增所需组份，具体包含Tris 10～50mM，MgCl₂10～40mM，dNTP 0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM；

(3)TB检测液：为恒温扩增时必需的TB引物和TB荧光探针溶解在TE溶液中配制而成，引物探针序列均选自长516bp TB 16S rRNA基因保守区，序列见序列表SEQ.ID.NO14；

(4)SAT酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含T7RNA聚合酶200～2000U/反应、M-MLV反转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH8.0、40～200mM KCl、1～10mM EDTA、2～20％(v/v)TritonX-100、10～40％(v/v)glycerol；

(5)TB阳性对照；为含10²～10⁵CFU/ml结核分枝杆菌的菌液；

(6)TB阴性对照：为不含有SEQ.ID.NO14核酸序列或不含有结核分枝杆菌的的溶液。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述(1)中的稀释液液中RNase抑制剂的浓度为0.1～1％，其余成分为灭菌DEPC水。

3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述(3)中的TB检测液中TB荧光探针为分子信标。

4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的TB检测液中的探针包含有以下一种或几种序列：TB Probe：序列见序列表SEQ.ID.NO11-13。

5.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的TB检测液中，至少一条TB引物的5’端带有T7启动子序列。

6.根据权利要求5所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的引物序列含有以下一对或几对序列：

TB T7：序列见序列表SEQ.ID.NO1-5；

TB nT7：序列见序列表SEQ.ID.NO6-10。

7.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的TB阳性对照和TB临界弱阳性对照中结核分枝杆菌菌液，制备方法包括下列步骤：

(1)将H37Ra标准菌株扩大培养；

(2)采用细菌计数法对培养的菌液进行计数；

(3)将计数的培养物用TB稀释液稀释成阳性对照，所含菌液浓度为10²～10⁵CFU/ml；

(4)TB阳性对照用TB稀释液稀释100倍即为TB临界弱阳性对照，所含菌液浓度为1～10³CFU/ml。