[发明专利]加速引物的设计方法、靶分子的检测方法与检测用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及靶分子的扩增检测方法，涉及用于扩增靶分子的加速引物的设计方法、相应的检测方法、以及检测试剂盒。

背景技术

对生物体的基因分析，包括其功能结构、遗传性状等涉及对靶分子的序列操纵。靶基因的数量通常极其微少，体外扩增通常是其分析的基本起始步骤。随靶基因的扩增量富集至可检出后，核苷酸序列互补性的特征可用于目的基因的鉴定。

体外核酸序列扩增的技术方法中，聚合酶链式反应(PCR)方法是最早开发与应用的扩增技术，应用于基因克隆与分析等遗传工程中。PCR反应中特异序列指数式的扩增结果使其具有高灵敏度、高特异性的优点。特别是在病原体的诊断方面，较传统的细胞病变效应、基于免疫原理的酶联免疫反应等检测方法具有明显的优势。但是PCR方法仍存在一定的问题：实际操作中依赖于专用的温度自动调节设备，解决变性、复性、延伸的温度循环问题；存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点；相对操作时间及成本较高。

对于PCR更为具体的描述是，PCR等传统扩增技术依赖于扩增反应的每一循环中靶分子变性和复性的周期循环。DNA的热变性处理某种程度上会引起DNA分子的剪切，PCR的加热-冷却循环可能进一步损伤DNA，同时受到多种抑制剂的影响。这也是在病原体诊断中较低浓度靶分子模板不易检出的原因。由此，扩增反应中不依赖模板的周期性变性，反应温度保持恒定的等温扩增技术开始出现。

1992年后陆续出现一系列等温扩增技术，比如依赖于内切酶切割模板转换的链置换扩增法(SDA)，使用RNA聚合酶转录RNA序列的转录介导扩增法(TMA)和基于核酸序列的扩增法(NASBA)，针对环状模板的的滚环扩增法(RCA)、环状探针的分枝扩增法(RAM)，以及最近使用的解旋酶替代热变性以解开DNA链的解旋酶依赖性等温DNA扩增法(HDA)。这些技术受到对所述扩增具有不同稳定性的多种试剂的数量以及对设备依赖性的限制。参见，例如US4683195，US4683202，US5427930，US5339491，US5409818，EP 0329822，EPA 320308(连接酶反应)。

利用一些DNA聚合酶伴链置换功能的特性，开发出环介导等温扩增(LAMP)法(U.S 64102778)的技术。LAMP法是使用内侧引物对、外侧引物对、进而任意添加环引物，以成环自引延伸的方式来扩增特定靶分子的基因分析技术。LAMP法与PCR法相比，终产物的量生成多(扩增产生＞500ug/ml的DNA)，而且操作简单、快速、经济。在病毒基因检测方面发明人已有采用LAMP技术进行大规模HBV临床诊断的报道。LAMP技术已成功应用于包括植物、动物、人体及微生物的实验室检测。LAMP法是基因诊断领域可预见的具有广泛应用基础的快速检测技术。

在LAMP的引物设计中，已知有效的模板扩增长度一般＜200个碱基。长度超过250的模板靶序列将影响扩增效率，长度超过350碱基的模板靶序列扩增效率低下。但在实际的应用中，靶分子模板存在如基因组的多态性，长片段模板扩增等问题。本发明的发明人现在已开发利用加速引物的策略，可以使用较长模板序列而不影响扩增效率或使扩增效率进一步增强，继之可以进一步优化调整LAMP中其他引物的位置与序列。

发明内容

LAMP的扩增效率受到靶分子模板靶序列结构、多态性与长度的影响。在扩增复杂序列结构、多态性较为复杂模板或较长序列模板时，扩增效率不明确的因素很多。本发明鉴于上述事实而发明加速引物的策略，其目的在于提供用于改善LAMP扩增效率以获得能够以更高精度进行检测LAMP扩增产物的引物设计方法。

本发明包括：一种加速引物的设计方法，一种靶分子的检测方法，用于DNA、RNA等温扩增的试剂盒及其在核酸检测中的应用。

本发明一种加速引物的设计方法，通过使用多个引物使靶分子得到加速等温扩增，其特殊之处是，所述靶分子从5’末端向3’末端开始依次为F3区域、F2区域和F1区域，从3’末端向5’末端开始依次为B3区域、B2区域和B1区域，所述F1区域至B1区域的部分上具有FB区域；当所述多个引物为在3’末端侧具有与所述F2区域相同序列且在5’末端侧具有与所述F1区域互补序列的FIP引物、具有与所述F3区域相同序列的F3引物、在3’末端侧具有与所述B2区域互补序列且在5’末端侧具有与所述B1区域相同序列的BIP引物、以及具有与所述B3区域互补序列的B3引物时，按照所述FB区域不同的位置处提供互补链合成起点的引物为加速引物。