[发明专利]用标记探针进行检测和熔解曲线分析的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用标记探针进行核酸检测和熔解曲线分析的技术领域，特别是涉及采用双标记寡核苷酸探针对含有至少一个突变核苷酸的靶核酸序列进行分析的方法。

背景技术

Real-time PCR可以用来检测和定量靶核酸序列。如今许多以探针为基础的方法应用于real-time PCR中，例如TaqMan探针(U.S.Pat.Nos.5,210,015 and 5,487,972)，分子信标探针(molecularbeacons，U.S.Pat.Nos.5,925,517 and 6,103,476)，自我检测扩增子(self-probing amplicons)，也称scorpions(U.S.Pat.No.6,326,145)，Amplifluor(Chen et al.，Appl.Environ.Microbiol.64：4210-6，1998)，Amplifluor(U.S.Pat.No.6,117,635)，置换杂交探针(Li et al.，Nucleic Acids Res.30：E5，2002)，DzyNA-PCR(Todd et al.，Clin.Chem.46：625-30，2000)，荧光限制性内切酶检测(Cairns et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.318：684-90，2004)，相邻杂交探针(U.S.Pat.No.6,174,670和Wittwer et al.，Biotechniques 22：130-1，134-8，1997)等。总而言之，荧光标记的探针提高了靶序列定量的特异性。

关于基因型多态性和稀有突变的检测已经申请了很多专利。突变的检测对于病理性突变的早期诊断是非常重要的，尤其是对于癌症和耐药的突变检测更为重要。近年来报到了很多检测突变的方法，期间基于real-time PCR技术鉴别等位基因的方法也得到了发展，两种主要的技术已被广泛应用。其中一种主要技术为，荧光信号是在每个PCR循环的结束时通过探针的杂交或水解产生的，例如TaqMan探针和分子信标探针技术。荧光检测一定是在PCR过程中或结束时。这些技术由于等位基因的特异性而需要使用两条探针，其中一条探针对应第一个等位基因，另外一条探针对应第二个等位基因。另外一种主要技术为，通过熔解曲线分析来检测突变，同样通常需要两条探针进行熔解曲线分析，例如邻近杂交探针。近年来，出现了一种单标记探针(U.S.Pat.No.6,635,427)。较高的荧光背景和对序列特异核苷酸的依赖让单标记探针具有一定的局限性。基于双标记TaqMan探针的熔解曲线分析方法也有报道(Housni et al.，2003)。然而，这个报道中的标记TaqMan探针的检测方法也有其局限性。首先，它使用了具有5’核酸酶活性的Taq聚合酶，为了防止发生常规TaqManreal-time PCR延伸步骤中探针的水解，所选探针的熔解温度(Tm值)要比PCR引物的Tm值低10℃，由于探针的Tm值较低，因此探针的杂交效率也较低，而造成最终的荧光检测信号也比较弱，探针的Tm值较低也就意味着探针较短，这就使得探针没有办法覆盖到靶序列较长的距离，这对于检测一个基因核心区域的一连串突变是很不利的，例如TB耐药中RpoB基因的核心区域；其次，以TaqMan探针为基础的熔解曲线分析一般不适用于长探针，由于报告标记和猝灭标记被长距离的核苷酸所隔离，而使报告标记和猝灭标记无法相互作用。对于一个长的TaqMan探针，很难检测到探针杂交状态和处于单链状态时荧光强度的差异。在现有的技术方法中，TaqMan real-time PCR方法可以在每个循环实时检测荧光信号，但通常不能进行熔解曲线分析。Housni等报道的改进后的基于TaqMan的方法，当探针遇到合适的条件时能够进行熔解曲线分析，但不能在每个循环实时检测荧光信号。基于分子信探针的方法可以在每个循环实时检测荧光信号，但不能对探针与靶序列杂交的混合物进行熔解曲线分析。邻近杂交探针可以进行实时检测和熔解曲线分析，但同时需要两条探针，一条探针用于锚定，另外一条探针用于报告。

这就需要一种改进的探针用于实时监测PCR反应和/或进行熔解曲线分析，同时也需要一种可以覆盖包含多个突变位点的靶序列较大区域的探针。

发明内容

本发明的目的是提供一种用标记探针进行检测和熔解曲线分析的方法。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

首先，提供一种从样本中检测靶核酸序列的方法，包括：