[发明专利]用标记探针进行检测和熔解曲线分析的方法

权利要求书

1.一种从样本中检测靶核酸序列的方法，包括：

在一个扩增体系中扩增靶序列，所述的扩增体系包括至少一条标记的寡核苷酸探针，一对扩增引物和一个热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶；

所述标记的寡核苷酸探针与扩增的靶核酸杂交形成的熔解曲线分析中产生一个熔解谱；

所述标记的寡核苷酸探针包括一个报告标记和一个猝灭标记，当标记的寡核苷酸探针处于未与靶序列杂交的单链构象时，猝灭标记能够猝灭报告标记所发出的荧光；当标记的寡核苷酸探针与靶序列杂交时，形成双链结构，报告标记的荧光不能够被猝灭，此时，报告标记的荧光强度要远高于此寡核苷酸探针未与靶序列杂交而处于单链状态时的荧光强度；

所述的扩增是不对称扩增，扩增中一条引物的浓度高于另外一条与之配对引物的浓度。

2.按照权利要求1中的方法，所述的不对称扩增是PCR，热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶是经过修饰的、无5’核酸酶活性的Taq聚合酶。

3.按照权利要求1中的方法，所述猝灭标记是非荧光猝灭基团，它标记在寡核苷酸探针的3’末端；所述报告标记是荧光基团，它标记在寡核苷酸探针内部的核苷酸残基上或5’末端。

4.按照权利要求1中的方法，所述标记的寡核苷酸探针的熔解温度(Tm)高于扩增引物的熔解温度(Tm)值。

5.按照权利要求1中的方法，还包括在扩增期间，在每个循环实时检测杂交依赖的荧光信号。

6.按照权利要求2中的方法，其中一对PCR引物的比例为小于1∶2.

7.按照权利要求1中的方法，其中引物对有一个退火温度，寡核苷酸探针有一个Tm值，探针的Tm值高于引物的退火温度0～20℃。

8.按照权利要求1中的方法，靶核酸序列与探针的杂交区域至少要包含一个、两个甚至更多突变核苷酸、单核苷酸多态性(SNP)、缺失或插入。

9.一个用于实时监测PCR反应和/或进行熔解曲线分析的标记的寡核苷酸探针，包括：

所述标记的寡核苷酸探针包括一个报告标记和一个猝灭标记，当标记的寡核苷酸探针处于未与靶序列杂交的单链构象时，猝灭标记能够猝灭报告标记所发出的荧光；当标记的寡核苷酸探针与靶序列杂交时，形成双链结构，报告标记的荧光不能够被猝灭，此时，报告标记的荧光强度要远高于此寡核苷酸探针未与靶序列杂交而处于单链状态时的荧光强度；

其中所述猝灭标记是非荧光猝灭基团，且标记在寡核苷酸探针的3’末端；

所述报告标记是荧光基团，它标记在寡核苷酸探针的内部核苷酸残基上或5‘末端；

所述寡核苷酸探针包括至少25个核苷酸；

所述报告标记和猝灭标记位于25个核苷酸以内；

所述标记的寡核苷酸探针与热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶配合使用。

10.一个从样本中检测靶核酸序列的试剂盒，包括：

①至少一条标记的寡核苷酸探针，标记的寡核苷酸探针包括一个报告标记和一个猝灭标记，当标记的寡核苷酸探针处于未与靶序列杂交的单链构象时，猝灭标记能够猝灭报告标记所发出的荧光；当标记的的寡核苷酸探针与靶序列杂交时，形成双链结构，报告标记的荧光不能够被猝灭，此时，报告标记的荧光强度要远高于此寡核苷酸探针未与靶序列杂交而处于单链状态时的荧光强度；

其中所述标记的寡核苷酸探针的熔解温度(Tm)高于扩增引物的熔解温度(Tm)值；

其中所述猝灭标记是非荧光猝灭基团，且标记在寡核苷酸探针的3’末端；

其中所述报告标记是荧光基团，它标记在寡核苷酸探针的内部核苷酸残基上或5’末端；

②热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶及核酸序列扩增所需其余常用各组分。