[发明专利]微生物发酵生产低温淀粉酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温淀粉酶微生物发酵生产方法。该发明生产的低温淀粉酶主要应用于食品加工、中草药提取、造纸、纺织、印染、洗涤、环境保护以及其它淀粉酶应用行业。可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。

背景技术

淀粉酶是催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其他低聚糖的一组酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中(钱海丰等，西北农业学报，2003)。淀粉酶作为生物制剂，已经广泛应用于食品加工、中草药提取、造纸、纺织、印染、洗涤、环境保护以及其它淀粉酶应用行业。国内外目前使用的淀粉酶主要为中温和高温型淀粉酶。有关低温淀粉酶的研究是起步阶段，主要研究菌种选育、发酵条件优化、酶学性质以及相关基因克隆等(张刚等，海洋科学，2002；傅力等，农产品加工，2007；王淑军等，中国酿造，2008；刘志培等，环境科学，2009)；而低温淀粉酶产业化、规模化生产及应用还未见报道。低温淀粉酶与高温、中温淀粉酶相比具有很大的应用优势，因为低温淀粉酶在低温条件下具有高酶活力及高催化效率；可减少加工工艺，缩短加工过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理可使低温酶的活力丧失；低温或适温处理有助于提高产品品质和质量(孙谧等，海洋水产研究，2002)，低温淀粉酶上述特性有助于其推广和应用。低温淀粉酶的应用将对传统的农业、食品、医药、轻工、能源和环保等领域产生深远的影响。利用微生物发酵生产的低温淀粉酶，按原料重量0.1‰～0.5‰的量添加于生料发酵、食品加工和多孔淀粉生产等领域中，在7～20℃处理0.5～1.5h，可以提高原料的转化率15.4％～24.8％，降低了生产成本，改善并提高产品质量，从根本上摆脱中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。低温淀粉酶具有非常巨大的开发潜力和应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温淀粉酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在14～20℃液体发酵生产低温淀粉酶的方法，这种生产方法获得的低温淀粉酶粗酶液活性可以达到199.8U/mL，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。当该酶制剂活性为1000U/mL或1000U/g，0.1‰～0.5‰的添加量应用于生料发酵、食品加工和多孔淀粉生产等领域中，在6～18℃处理0.5～1.5h，可以提高原料的转化率15.4％～24.8％。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。

本发明所述的一种微生物发酵生产低温淀粉酶的方法具体包括以下步骤：

(1)将产生淀粉酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；

(2)按常规方法将低温驯化后的淀粉酶产生菌在14～20℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；

(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的2～8％接种量接入产酶培养基中，在14～20℃培养48～144h时，即微生物发酵生产低温淀粉酶结束；

(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；

(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。

本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。淀粉酶产生菌(例如，CGMCC菌种编号：1.2323^T或1.447或1.504等)，菌株先活化，再经过逐级低温驯化，发酵生产低温淀粉酶时按本发明方法进行培养。低温驯化后的菌株在4℃环境中可保存2个月，用25～40％甘油制成的菌悬液在零下80℃条件下可以长期保藏。

具体实施方式：

实施例一：

(1)培养基制备

①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。

②菌种低温驯化培养基：淀粉10.0～20.0g，蛋白胨10.0～20.0g，NaCl 7.0～12.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值7.0～7.6，121℃高压蒸气灭菌30min。