[发明专利]一种海洋贝毒素单抗制备方法

权利要求书

1.一种海洋贝毒素单抗制备方法，其特征在于：制备小分子贝毒素单抗用于动物免疫和杂交瘤筛选的抗原为同一偶联物，并采用了正筛法和负筛法相结合的筛选法进行小分子贝毒素单抗杂交瘤细胞的筛选，其步骤如下：

(1)、抗原的制备

采用活泼酯法制备免疫原兼检测原，操作方法如下：1mg贝毒素大田软海绵酸OA、0.155mg N-羟丁二酰亚胺、0.285mg N，N双环乙烷碳二亚胺于100μL N，N二甲基甲酰胺N，N-DMF中混均，室温孵育2h，以载体蛋白与小分子物质摩尔比为1∶20～1∶50的比例加入载体蛋白，并试先用50μL 0.1mol/LN_aHCO₃溶解，室温继续孵育2h，未反应的物质通过超滤离心去除，将偶联抗原用一定体积的PBS缓冲液(pH 7.4)溶起，-20℃保存备用；

(2)、动物免疫与效价测定

采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100μg偶联抗原与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2d；3周后再用100μg偶联抗原与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫。此后每2周用半量偶联抗原重复腹腔加强免疫；用载体竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA程序如下：偶联抗原用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃过夜；用PBST洗板3次，每次3min；加入载体蛋白1μg/mL与等量系列稀释的血清共100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG1：4000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺OPD显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照；

(3)、细胞融合与筛选

效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫1次，3d后取脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进行筛选：

①负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体抗原用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96孔酶标板，用PBST洗板3次，每次3min；加入细胞培养上清液100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG1：4000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺OPD显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；

②正筛选择针对OA的目标克隆：用贝毒素偶联抗原筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞：用偶联抗原1μg/mL包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG1：4000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺OPD显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值；选择阳性克隆进入下一轮筛选；

③竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的贝毒素阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用偶联抗原1μg/mL包被ELISA板，洗涤后加入OA标准品20ng/mL与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG1：4000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺OPD显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的一种海洋贝毒素单抗制备方法，其特征在于所述的海洋贝毒素是腹泻性贝毒素大田软海绵酸，所述的免疫原兼检测原为大田软海绵酸与载体蛋白牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA或人免疫球蛋白hIgG等经活泼酯法制备的偶联物；其大田软海绵酸单克隆抗体属于IgG1亚类，相对分子质量约为160kD，抗体滴度为2.56×10⁶，抗体亲和力为9.0×10⁸L/mol。

3.根据权利要求1所述的一种海洋贝毒素单抗制备方法，其特征在于所述的在单抗杂交瘤细胞筛选过程中采用了正筛负筛相结合的筛选法，即先用载体蛋白对融合杂交瘤细胞进行筛选，去除大量针对载体蛋白呈阳性的杂交瘤细胞株；阴性克隆继续用免疫原兼检测原与标准品竞争筛选针对目标毒素的杂交瘤。