[发明专利]双向一步PCR基因分型的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及单位点或多位点SNP测定方法领域，具体地涉及一种采用双向一步PCR基因分型法检测SNP。

背景技术

SNP(single nucleotide polymophism)，即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP在人基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点，是继微卫星之后的第三代遗传标记。有些SNP位点还会影响基因的功能，从而导致生物性状改变甚至致病。

SNP研究包括SNP发现(discovery)、SNP验证(validation)以及SNP筛选(Screening or Scoring)。广泛用于群体遗传学研究(如生物的起源、进化及迁移等方面，将逐渐取代微卫星而成为新一代的分子生物学标记)，和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。

目前已有多种方法可用于SNP检测，如根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。

传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。这些技术在某种程度上都能完成对SNP的检测，但技术相对较复杂而且对仪器要求较高。以下是各种方法的比较。

1.测序法

最经典的方法，无须再用其它手段验证。具体步骤：引物设计与合成----PCR---纯化---测序。但成本较高。

2.巢式PCR-RFLP法

不同于传统的RFLP技术，不仅是有酶切位点的SNP，可对任意一个SNP位点进行酶切位点改造，使该位点变成常见酶切位点而进行鉴定。但过程复杂，步骤多。

3.Real time-PCR法

应用ABI 7900HT系统(含软件)，适合于位点数量少，样本通量高的检测。但探针合成费用高。

4.SNP stream UHT genotyping技术

采用BEAKMAN独家专利技术(单碱基引物延伸技术)，准确率高达99％，和测序一样是检测SNP的金标准。需要样品量低，速度快，但仪器要求高。大致流程：序列比对----引物设计(12重或48重)----引物合成----DNA抽提和定量---PCR---纯化-----单碱基延伸反应----杂交-----扫描----分析。

5.芯片检测法(affymetrix genechip)

应用特殊技术。但涉及的技术及设备非常专业、复杂，运行成本很高。

发明内容：

本发明的目的是提供一种双向一步PCR基因分型的新方法，针对主要与形状有关的基因型设计特殊引物，用PCR的方法同时可以对单个或多个位点的基因型同时测定。每一个电泳条带都代表着一个位点的基因型。并且通过完整的电泳图谱可以给出不同位置基因型的结果。

本发明采用的技术方案是：一种双向一步PCR基因分型的新方法，其步骤如下：

a)根据SNP位点的基因型设计5’末端模板不匹配或5’末端封闭的特异性PCR引物；

b)采用5’末端模板不匹配或5’末端封闭的特异性PCR引物，从SNP位点同时分别向两个方向进行PCR；

c)SNP位点远端的外端引物用来控制PCR产物的长度；

d)根据两个方向的PCR产物长度的不同和DNA序列的不同，对两方向的PCR产物加以检测，从而得到SNP的结果。

所述的5’末端模板不匹配的特异性PCR引物为一系列引物，它们的3’末端分别与不同的基因型相匹配。

所述的5’末端模板不匹配的特异性PCR引物的5’末端不被核酸外切酶所降解。

所述的PCR为一系列PCR，每一PCR由一个SNP位点的特异性PCR引物和一个SNP位点远端的外端引物来完成，或任何一对相对引物完成。

所述的外端引物为PCR引物，其5’-3’指向为由SNP位点远端指向SNP位点。

所述的步骤d)中，根据两个方向的PCR产物长度的不同和DNA序列的不同，对两方向的PCR产物加以检测，是指用电泳及荧光探针定性或定量检测。