[发明专利]检测常见高危型人乳头瘤病毒的方法及试剂盒

说明书

发明领域

本发明涉及检测临床样品中常见高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV，High-RiskHuman Pappillomavirus)DNA的方法，特别是涉及使用实时聚合酶链反应(PCR)方法检测HPV。该方法使用分子信标荧光探针技术，能特异且灵敏地检测出临床样品中13种常见的高危型人乳头瘤病毒DNA。本发明还进一步涉及用于该临床检测的试剂盒。

发明背景

宫颈癌(CC)是女性最常见的恶性肿瘤之一，在女性人群中，其致死率仅次于乳腺癌。据估计，全球每年约新增病例大约473,000，每年死于宫颈癌的人数可高达253,500，约85％发生在发展中国家(http://www.nccc-online.org/)。我国每年新增病例13.15万，约3.5万人死于宫颈癌。近年来，随着环境污染和社会风气的变化，原本多发于50岁左右女性身上的宫颈癌如今也盯上了年轻女性。所以，宫颈癌的预防、诊断和治疗对提高女性健康水平是非常必要的。

所幸的是，宫颈癌是一种发病原因比较清楚的恶性肿瘤，约99.7％的宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒的持续或反复感染所致(Walboomers JM，Jacobs MV.Manos MM，et al.J Pathol，1999；189(1)：50-53)。目前已确定的HPV型别已超过150个，常见的高危型有15种(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82型)(N，Bosch FX，de SanjoséS，Herrero R，CastellsaguéX，Shah KV，Snijders PJ，Meijer CJ(2003).N.Engl.J.Med.348(6)：518-27.)。其中，70％的宫颈癌是由HPV16、18引起的；另外，HPV31、33、35也是宫颈癌的主要致病因素(Walboomers JM，Jacobs MV，Manos MM，Bosch FX，Kummer JA，Shah KV，Snijders PJ，Peto J，Meijer CJ，N(1999).J.Pathol.189(1)：12-9)。HPV型别分布有地域差别，在中国人群中，HPV16、52、58相对多见，而HPV73、82几乎没有。

过去，宫颈癌筛查的主要方法有巴氏涂片法、阴道镜检查法及组织活检等，这些方法缺点明显，灵敏度不高特异性不强。而近年来出现的HPV DNA或RNA的检测对诊断高度病变的宫颈癌的灵敏度可达80％-100％，阴性预测值几乎是100％，所以，这种方法目前被认为是诊断宫颈癌的金标准。有研究者提出，对宫颈癌的准确诊断需要HPV DNA或RNA检测结果和细胞学检测结果的综合分析(Walboomers JM，Jacobs MV，Manos MM，Bosch FX，Kummer JA，Shah KV，Snijders PJ，Peto J，Meijer CJ，N(1999).J.Pathol.189(1)：12-9)。

检测HPV DNA或RNA的常见方法包括测序法、杂交捕获法、原位杂交法及PCR法。测序法的结果相对准确，但操作繁琐，且对操作者的要求较高，不适于临床应用；杂交捕获法如Digene公司的Hybrid CaptureII已被美国FDA批准并已在临床上应用，该法假阳性的问题仍然十分严重，且成本高，不宜在经济较不发达的发展中国家推广；原位杂交法灵敏度过低，这也就限制了其在临床上的大规模应用；传统的PCR法(电泳鉴定结果)虽然灵敏度尚可，但扩增后的产物暴露容易造成交叉污染，且步骤繁琐，临床应用的局限性过大。而上世纪90年代中期在传统的PCR基础上发展起来的实时荧光PCR技术不但灵敏度高特异性强，自动化程度高，成本适中，几乎不会造成污染，这些优点无疑给人乳头瘤病毒的早期诊断带来了福音。