[发明专利]鸡多重病毒核酸探针斑点杂交检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡多重病毒核酸探针斑点杂交检测试剂盒，属于兽用生物制品领域。

背景技术

在鸡群中，不同病毒特点是免疫抑制性病毒感染已非常普遍。如I型鸡马立克氏病毒(Marek’s disense Virus，Serotyres，MDV)、禽网状内皮增生病病毒(ReticuloendotheliosisVirus，REV)、鸡传染性贫血病毒(Chick infectious anemia Virus，CAV)、禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus，ARV)、鸡传染性支气管炎病毒(chicken infectious bronchitis virus，IBV)N蛋白基因(IBV-N)。这些病单独感染雏鸡后，除在少数鸡引起特定病理变化和症状甚至死亡外，对多数鸡往往只显示轻微的致病作用，只呈现亚临床感染。但是，如果有二种或二种以上病毒同时感染一只鸡时，它们在致病性上的协同作用可能使病程更为严重。在鸡场遇到的一些发病死亡，往往是不同病毒和细菌共同感染的结果。因此，如果能对一只鸡同一份样品对不同病毒感染作病原学检测，将有助于阐明一个鸡群发病的真正原因。

本发明内容

本发明的目的在于提供一种能对一只鸡同一份样品对不同病毒感染(I型鸡马立克氏病毒(MDV₁)、禽网状内皮增生病病毒(REV)、鸡传染性贫血病毒(CAV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作病原学检测，将有助于阐明一个鸡群发病的真正原因的检测试剂盒。

本发明所涉及的试剂盒是分别利用MDV₁特异性的pp38基因、CAV的vp₁基因、REV的pol基因和ARV的sigma c基因、IBV-N蛋白基因为模板，用特定引物通过PCR合成了经狄高辛(Digoxiaenin，DIG)标记的特异性核酸探针。通过斑点分子杂交，这些探针将可用于检测病料样品中某种病毒特异性核酸的存在，用于判定有无某种病毒感染。利用这一方法，在1张8×8cm大小的硝酸纤维膜或尼龙膜上可同时检测约100份病料的核酸样品。病料在组织样品核酸提取后，斑点分子杂交可在24～36小时内完成检测并报告结果。如将同一样品的核酸提取物分点在五张膜上，即可同时检测四种不同的病毒。

发明的详细描述

一、核酸探针及基因DNA对照品的制备

1.MDV

(1)MDV-pp38核酸探针标记

1)以本发明人保存的MDV-pp38基因(姜世金，丁家波，孟珊珊等.型马立克氏病病毒pp38和pp24基的真核表达.中国病毒学，2005年20卷4期)，基因大小为981bp作为模版用所设计并合成的一对引物(序列1、2)扩增出片段大小为641BP产物(序列3)，此段序列为I型MDV特异性的。

所用引物(序列1、2)

pp38-F：AGGCAGGGCATGGGAAAACAGAAG

pp38-R：ACCGACTAACATACCAGCGAAAAA

2)探针标记反应程序(标记效果较好的程序)

*PCR DIG探针合成混合物为含有DIG-11-dUTP的d NTP的混和物，购自Roche公司

PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性40sec，55℃退火40sec，72℃延伸50sec，共32个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。由此合成的为有DIG标记的641pb的探针DNA.。

(2)MDV-pp38基因DNA(未标记对照)的PCR扩增

PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性40sec，55℃退火40sec，72℃延伸50sec，共32个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。由此合成如序列3所述核酸序列的为未标记的641pb DNA作为阳性对照或其他基因探针的阴性对照。

(3)电泳结果见图1，同样是641bp，有DIG标记的探针DNA分子量大，电泳中变慢。(样品各取2μl，maker2000各5μl和10μl电泳)

(4)定量结果探针标记量为50ng/μl；共10管(1100μ1)，110μl/管(5.5μg/管)；总量为55μg。

2.REV

(1)REV-pol核酸探针标记