[发明专利]一种治疗乙型肝炎的重组质粒DNA疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗乙肝疾病的重组质粒DNA疫苗，属于生物医学领域。

背景技术

乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段，乙肝慢性化的主要原因是乙肝病毒(HBV)感染后机体缺乏持久的特异性细胞免疫及体液免疫。HBV外壳蛋白是有大蛋白LS(S1S2S抗原，由前S1-前S2-S基因编码)、中蛋白MS(S2S抗原，由前S2-S基因编码)、小蛋白S(S抗原，由S基因编码)三种分子构成，其中，前S2抗原分子量小，抗原性强，涉及乙肝病毒对宿主细胞的吸附，因而含前S抗原的疫苗最被接种者的保护作用应更为有效，在HBV感染后的病毒清除方面发挥重要作用。

重组质粒DNA疫苗是把外源基因克隆到真核表达载体上，然后将重组质粒直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。与传统的疫苗相比，重组质粒DNA疫苗不仅能有效诱导体液免疫，还能诱导细胞免疫，DNA质粒疫苗(基因疫苗)已经在许多疾病的治疗和预防方面显示出广泛的应用前景。近年来，国内外学者在乙型肝炎病毒DNA疫苗的构建和免疫效果方面进行了大量的研究，由于载体大小不同以及载体DNA结构中，有无免疫刺激序列均会影响DNA疫苗引发的免疫效果。在现阶段的研究中，构建的乙型肝炎病毒DNA疫苗所用的质粒所用的载体中大都缺乏免疫增强的成分，如所用的载体pcDNA3.1、pVAX1、pHBVα等，载体分子量较小，缺乏免疫刺激序列，当用这些载体构建的重组DNA疫苗对人体进行免疫治疗时，所起得的免疫治疗效果也相对较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的治疗乙肝的重组质粒DNA疫苗，本发明所述的重组质粒DNA疫苗在传统DNA疫苗载体基础上加入了一些提高外源抗原蛋白表达及刺激机体免疫反应的功能元件，在动物实验免疫时，可获得更好的细胞免疫和体液免疫效果。

具体地，本发明所述的治疗乙肝的重组质粒DNA疫苗携带乙肝病毒(HBV)蛋白编码基因，并含有大肠杆菌复制起始点ColE1、卡那抗性基因序列Kan、来源于SV40的增强子元件Enhancer、转录调控元件内含子Intron1和外显子Exon1、来源于HBV的转录后调节元件HPRE及免疫调节序列CpG等元件，其中乙肝病毒蛋白基因受增强子、巨细胞病毒启动子、转录调控元件Intron1和Exon1及转录后调节元件HPRE和牛生长激素基因的聚腺苷酸信号调控。

本发明中，所述的重组质粒DNA疫苗还可携带有多克隆位点区MCS，所述的多克隆位点区包括SwaI、KpnI、SaII、EcoRv、BgIII等酶切位点。

本发明中，质粒中所含的HBV蛋白编码基因可以是S1S2S或S2S或S蛋白编码基因中的任意一种，优选HBV包膜中S2S蛋白编码基因。

本发明中S2S编码基因可以是HBV蛋白中的B亚型的preS2S编码基因，也可以是C亚型的preS2S编码基因，优选C亚型的preS2S编码基因。

本发明的再一目的在于提供一种构建本发明所述的重组疫苗质粒的方法，具体包括：

(1)先构建重组质粒载体骨架pOE-EKS，其核苷酸序列为Seq No.1所标示的核苷酸序列：

以pDRVISV1.0为模板，以Primer1与Primer2为引物，其中引物2为5’末端磷酸化的引物，扩增获得大小为748bp的复制子区域(Ori)，同时引入EcoRI、KpnI及SwaI酶切位点；

Primer1：5’-GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3’

Primer2：5’-CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3’

以pDRVISV1.0为模板，以Primer3与Primer4为引物，其中引物3为5’末端磷酸化的引物，扩增获得大小为1056bp的卡那抗性标记基因(Kan)，同时引入EcoRI酶切位点，

Primer3：5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3’

Primer4：5’-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3’

将上述两个片段分别以EcoRI进行单酶切，连接后构建重组克隆pOK-EKS；

(2)构建重组质粒DNA疫苗pRec2.0-cPreS2.S