[发明专利]一种治疗乙型肝炎的重组质粒DNA疫苗

权利要求书

1.一种用于治疗乙肝的重组质粒DNA疫苗，其特征在于所述重组疫苗质粒DNA疫苗携带乙肝病毒蛋白编码基因，并含有大肠杆菌复制起始点ColE1、卡那霉素抗性基因序列Kan、以及来源于SV40的增强子元件Enhancer、转录调控元件内含子Intron1、来源于HBV转录后调节元件HPRE及免疫调节元件CpG，所述乙肝病毒蛋白编码基因受增强子、巨细胞病毒启动子、转录调控元件Intron1及转录后调节元件HPRE和牛生长激素基因的聚腺苷酸信号调控。

2.根据权利要求1所述的重组质粒DNA疫苗，其特征是所述的乙肝病毒蛋白编码基因为乙肝病毒包膜中蛋白S2S蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的重组质粒DNA疫苗，其特征是所述的S2S蛋白编码基因是指HBV包膜蛋白中的C亚型preS2S蛋白的编码基因。

4.一种制备权利要求1-3中任意一权利要求所述的重组质粒DNA疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)先构建重组质粒载体骨架pOE-EKS，其核苷酸序列为Seq No.1所标示的核苷酸序列：

以pDRVISV1.0为模板，以Primer1与Primer2为引物，其中引物2为5’末端磷酸化的引物，扩增获得大小为748bp的复制子区域(Ori)，同时引入EcoRI、KpnI及SwaI酶切位点；

Primer1：5’-GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3’

Primer2：5’-CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3’

以pDRVISV1.0为模板，以Primer3与Primer4为引物，其中引物3为5’末端磷酸化的引物，扩增获得大小为1056bp的卡那抗性标记基因(Kan)，同时引入EcoRI酶切位点；

Primer3：5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3’

Primer4：5’-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3’

将上述两个片段分别以EcoRI进行单酶切，连接后构建重组克隆pOK-EKS；

(2)构建重组质粒DNA疫苗pRec2.0-cPreS2.S

将合成基因cPreS2S通过XhoI+XbaI双酶切与SalI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-cPreS2S；

以pDRVISV1.0为模板，以Primer5与Primer6为引物，扩增获得大小为271bp的BGHpolyA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入BglII-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+KpnI双酶切后克隆入BglII+KpnI双酶切的pHPRE-cPreS2S载体中，获得重组质粒pHPRE’-cPreS2S；

Primer5：5’-CGGGATCCgctgtgcct tctagttgccag-3’

Primer6：5’-GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATCC-3’

通过EcoRI+KpnI将重组质粒pHPRE’-cPreS2S的cPreS2S表达盒克隆入载体pOK-EKS中，构建重组质粒pRec2.0-cPreS2S，其核苷酸序列为Seq No.2所标示的核苷酸序列。

5.一种含有权利要求1-3中任一权利要求所述重组质粒DNA疫苗的组合物。

6.权利要求1-3中任意一权利要求所述重组质粒DNA疫苗在制备具有预防和治疗乙型病毒性肝炎药物中的应用。

7.权利要求5所述的组合物在制备具有预防和治疗乙型病毒性肝炎药物中的应用。