[发明专利]一种干燥羊膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种羊膜的制备方法，尤其是涉及一种干燥羊膜的制备方法。

背景技术

羊膜来源于胚胎，是一种透明、无神经、血管和淋巴管、低抗原性且具有韧性的组织。该膜由上皮细胞层、基底膜、基质层、纤维母细胞层、海绵层组成，厚约0.02～0.05mm。羊膜上皮层为单层立方上皮，细胞表面及侧面有很多微绒毛，有合成、分泌和沉积基底膜、细胞外间质成份的能力，具有分化的潜能，并可以分泌多种生长因子；而羊膜基质含有丰富的胶元纤维及多种形式的蛋白酶抑制剂；羊膜基底膜是人体最厚的基底膜(约0.1μm)，含有IV型胶原纤维网，层粘连蛋白和富含硫酸肝素的蛋白多糖，可以起屏障作用，减低了羊膜的通透性。

随着新生血管、炎症及伤口愈合等相关疾病的患者人数增多，羊膜的使用也越来越多。羊膜的制备，尤其是羊膜活性成分的保存，也就成为目前研究的一个热点问题。目前市面上采用的多为直接经过冷冻的干燥羊膜-生物冻干羊膜，它是将附有羊膜的纸片置于冻干机，真空条件下用钴-60辐射烘干，并在室温下真空包装，室温下避光放置两个月，使用前需置于含庆大霉素的生理盐水中浸泡3min。该方法操作相对简单，成本较低，便于规模化批量生产，可长期保存，运输方便，但需要用到特殊的设备，冻干羊膜组织结构及上皮比较容易被破坏。目前还有一种干燥羊膜-海藻糖浸泡羊膜，它是将分离出的羊膜置于10％海藻糖溶液中浸泡，然后冻干，真空包装，射线辐照灭菌后避光保存。该方法保存的羊膜在形态学、生物学方面更接近于自然新鲜羊膜，但效果尚未得到更多证实。

发明内容

本发明提供一种干燥羊膜的制备方法，制得的干燥羊膜安全无污染、性能与新鲜羊膜接近、生物活性高、胶原破坏少、易于手术操作、运输及保存方便，作为新鲜羊膜的替代物，取材方便，实用性强，能被广大患者接受并应用于临床。

本发明采用如下技术方案：

一种干燥羊膜的制备方法，包括如下步骤：将反复漂洗的无病毒携带新鲜羊膜经过严格消毒，低温下基质重建及修复，铺膜，干燥，钴60消毒后保存备用。

如制备有色干燥羊膜，需包括以下步骤：将反复漂洗的无病毒携带新鲜羊膜经过严格消毒，低温下基质重建及修复，羊膜着色，铺膜，干燥，钴60消毒后保存备用。

所述的消毒是将新鲜羊膜用含抗菌素的PBS浸泡后，浸泡时间为5-10min，PBS冲洗3次×5min。所述的抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素，100mg/L链霉素中一种或两种以上的组合。

所述的基质重建及修复是将新鲜羊膜浸泡于基质胶内，其中所需温度为-20℃-4℃，时间为15min-30min，基质胶包括ECM胶，FN胶，Matrige胶，角叉菜胶，明胶，IV型胶原中的一种。采用本技术能使羊膜外面存在一层保护膜，使上皮和基质活性成份能得到大部分保存，细胞表型和基底膜完整，基质破坏极少。

所述的羊膜着色的有色染料包括荧光素钠，虎红，台盼蓝，龙胆紫，结晶紫，丽丝胺绿，酚红，美蓝，番红，甲基蓝及洋红中的一种，其中温度为16℃-37℃，染色时间30s-5min。采用本技术能很好的帮助我们在手术应用中分辨羊膜的折叠处和皱褶及边缘。

所述的铺膜包括硝酸纤维素膜，乙酸纤维素膜，微孔滤膜，盖玻片中的一种。采用本技术能使羊膜充分展平，保持一定的拉伸度同时还可以辨别羊膜上皮面。

所述的干燥技术处理为真空冻干，真空晾干，无水Cacl₂真空干燥，自然晾干，吹干，30-60℃温箱内烘干中的一种或一种以上的组合，干燥至羊膜材料的含水量在0.1-5％之间后取出。

所述的羊膜材料消毒技术采用钴60消毒。

我们采用本发明技术方案制作的羊膜材料，植入于兔皮下1个月，兔眼前房内和兔角膜基质囊袋内平铺术后1月均显示其具有良好组织相容性，没有见明显的炎症反应和排斥反应，同时将其用于羊膜结膜修补术后2周发现其羊膜基底膜尚完整，羊膜上有兔结膜上皮长入，无明显的排斥反应和炎症反应，说明其能作为结膜上皮的细胞基底膜用于结膜重建。