[发明专利]南非Ⅱ型口蹄疫多抗原表位蛋白、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种南非II型口蹄疫多抗原表位VP1～VP3蛋白、其制备方法及应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、高度接触性传染病，一度被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疫病之首。口蹄疫属于世界流行性传染病，它的爆发给全球人类健康以及畜牧业生产造成了极大的危害。

FMDV为正二十面体的单股正链RNA病毒，基因组长约8.5kb，含有一个大的开放性读码框，分为L、P1、P2和P3四个区域，其中P1区编码病毒的衣壳蛋白VP4、VP2、VP3和VP1，各60个分子的VP4、VP2、VP3和VP1构成病毒衣壳蛋白，VP1大部分暴露在病毒粒子的表面，是决定病毒抗原性的主要成分，可诱导感染动物产生中和抗体，VP4大部分埋在病毒内部，VP2和VP3介于VP4和VP1之间，四种结构多肽都参与免疫原性的构成。VP1～VP3组成衣壳蛋白亚单位，VP4位于病毒颗粒内部。P2基因编码3种病毒的非结构蛋白，2A、2B、2C。P3基因编码非结构蛋白3A、Vpg、3Cpro和3Dpol。

口蹄疫病毒有七个血清型，即O、A、C、SAT I、SAT II、SATIII和Asia I型。这七个血清型可根据同源性分为两群，O、A、C和Asia I型为第一群，SAT I、SAT II、SATIII为第二群，群内各型同源性达60％～70％，但两群之间同源性仅为25％～40％，口蹄疫病毒各血清型间无交叉反应，即使在同一血清型内，不同病毒的抗原性也有差别，这就给口蹄疫的检疫和防控增加了难度。

传统的口蹄疫诊断和检疫方法主要有补体结合试验(CFT)、间接血凝试验(PHA)、琼脂扩散试验(AGP)、病毒中和试验(VNT)，酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学方法，随着分子生物学的发展，RT-PCR技术和基因芯片技术的应用，使口蹄疫病毒的检测向着更敏感、特异、方便、快速的方向发展。1952年，Brooksby建立了CFT，病毒分离增殖和补体结合试验相结合的方法在口蹄疫诊断中沿用了近30年，尽管这种技术准确可靠，但不够敏感，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。间接血凝试验以红细胞为载体，根据致敏红细胞的抗原、抗体的特性，可用已知的抗原或抗体检测未知的抗体或抗原。目前已有商品化的口蹄疫间接血凝试剂盒，广泛应用于口蹄疫的抗体检测。琼脂扩散试验既可检测抗原，也可检测抗体。根据抗原抗体在凝胶中相互扩散，在最适比例产生沉淀线的原理，可用已知的抗原或抗体检测相应的抗体或抗原。病毒中和试验(VNT)也称血清中和试验，VNT既可鉴定抗原，又可对抗体定量测定，具有型特异性，是最经典的口蹄疫检测方法，是评价其它方法的金标准。RT-PCR技术用于口蹄疫病毒的检测，具有敏感性高、特异性好、快速，准确等优点，PCR产物还可以用来测序，进而得到更详细的流行病学信息，为研究口蹄疫病毒毒株演化提供资料。

ELISA检测口蹄疫具有特异性好、敏感性强、快速、简便、可靠等优点，且能自动化操作，适合于大量样品的快速检测，在口蹄疫的诊断中日益受到人们的重视，现已成为国际上检测口蹄疫的常规方法之一。传统的检测口蹄疫血清抗体的方法主要是采用BHK细胞培养的FMDV为抗原的间接ELISA方法，虽然这种方法的特异性和灵敏度较高，但在病毒的生产过程中易造成病毒的扩散，存在着许多安全隐患，需要BSL-3实验室环境。为此，许多研究者在大肠杆菌中表达了FMDV的结构蛋白和非结构蛋白，将其作为检测抗原，建立了多种FMDV的间接ELISA检测方法。

非洲是口蹄疫的自然疫源地，历史上南非II型(SAT II型)口蹄疫从未跨过赤道传播，这使得一些学者认为南非型口蹄疫需要非洲特殊的生存环境。但2000年发生在科威特和沙特阿拉伯的南非II型口蹄疫疫情，使人们发现，SAT II型口蹄疫不但可跨过赤道，还可跨过红海，到达亚洲大陆。特别是随着非洲经济的发展和世界市场的联系日益频繁，非洲大陆对外的逐步开放也将会使原本定居于非洲的疫病向世界各地散播。

随着我国与非洲国家的建交和贸易往来的频繁，我国受南非型口蹄疫的威胁越来越大，其中SAT II型对我国的威胁最大。我国目前在口蹄疫方面的研究只局限于O、A、C、Asia I型口蹄疫病毒，而对于SAT II型的研究，包括检测技术、疫苗完全处于空白状态。