[发明专利]利用靶杂交及检测引物进行靶检测

权利要求书

1.一种利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下的步骤：

步骤（a），对上述靶核酸序列与上述靶杂交及检测引物进行杂交，上述靶杂交及检测引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记；

步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，上述靶杂交及检测引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性而切割，从而上述靶杂交及检测引物放出上述标记或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；以及，

步骤（c），对上述信号进行检测，上述信号表示上述靶核酸序列的存在。

2.根据权利要求1所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（a）借助（i）上述靶杂交及检测引物以及（ii）利用标记探针来实施；上述标记探针使其3’-末端发生变形来防止模板-依赖性核酸聚合酶引起的延长，上述靶杂交及检测引物进行杂交的位点的下游位点进行杂交，且，在步骤（b）中被切割而放出与上述标记探针连接的标记。

3.根据权利要求1所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（a）借助（i）上述靶杂交及检测引物以及（ii）利用上游引物或者下游引物来实施；上述上游引物与上述靶杂交及检测引物杂交的位点的上游位点进行杂交，并且，与上述靶杂交及检测引物具有相同的方向；上述下游引物与上述靶杂交及检测引物杂交的位点的下游位点进行杂交，且与上述靶杂交及检测引物具有相同的方向。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括至少反复进行两次上述步骤（a）-步骤（b）或者步骤（a）-步骤（c）的步骤，以便扩增用于表示靶核酸序列存在的信号。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（c）的上述检测以实时方式、终-点方式或者预定时间间隔方式来实施。