[发明专利]存活蛋白mRNA的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用了核酸扩增方法的简便、迅速的存活蛋白mRNA的测定方法。更准确地说，本发明提供适合一定温度(40～50℃，优选43℃)下的存活蛋白mRNA的扩增、检测的寡核苷酸。本发明可用于分子生物学、生化学、医学领域等中的研究、诊疗。

背景技术

凋亡是细胞能动地导致自己死亡的现象，也称为程序性细胞死亡。已知人类这样的多细胞生物其体细胞由于病毒导致的感染、癌化等，而不断地产生不利于生命维持的细胞。除去这种细胞的系统是凋亡。除此之外，在发生的过程中，凋亡起到生命中不可缺少的作用。从昆虫到人类，凋亡以共通的机制发挥作用，其中已知胱天蛋白酶(caspase)是关键酶。抑制胱天蛋白酶、并抑制凋亡的物质是凋亡抑制因子(IAP)蛋白质。

典型的IAP蛋白质具有所谓的作为与蛋白质的结合结构域的BIR结构域、和作为一种锌指结构域的环指域的结构。近年，作为存活蛋白(survivin)已知的蛋白质被鉴定为凋亡抑制因子(IAP)基因家族的一员。存活蛋白代替单一的BIR结构域和环指具有卷曲螺旋区域，与已知的IAP家族成员相比结构特异。

作为存活蛋白的临床学上的重要性之一，报告了与其它的作为凋亡调节因子的Bcl-2、其它的IAP家族成员不同，在正常人体组织中几乎检测不到其表达，而在一般的人体的癌组织(肺、胰脏、大肠、膀胱、胸部、前列腺、胃、肝脏等)、非霍奇金淋巴瘤、白血病中显著地表达增加。这表示存活蛋白可以成为非常优异的标记基因。因此，认为存活蛋白mRNA的测定能够广泛地应用于癌症治疗等中的凋亡控制的监测、癌症的早期诊断、癌症的转移诊断、癌症的治疗效果监测等。

一般性的癌症的诊断是从病理学方面进行，但为此要求病理医生的高技术，并且根据使用的检测体而存在漏诊癌细胞的情况。近年，为了减少这样的漏诊、另外使各医院能够进行统一的诊断，提出利用核酸扩增方法的基因检查，甚或一部分被实用化。已知利用核酸扩增方法的基因检查的灵敏度高，在进行核酸扩增的基础上，与该检查的特异性高度相关的是所使用的癌标记基因的种类。如上所述，存活蛋白在广泛的癌症、淋巴瘤、白血病中能看到其高表达，另一方面，在正常细胞中几乎看不到其表达。因此，存活蛋白具有作为核酸扩增方法中的优异的癌标记的特征。即，通过调查各种组织中的存活蛋白mRNA表达的有无，能够发现癌、淋巴瘤、白血病等恶性疾病。

已知癌可以从原发部位向其它部位发生转移。即使是现在，转移也是癌症患者主要的死亡原因，与原发部位的诊断同样，转移诊断也非常重要。癌细胞从原发病灶部位放出到各种体液、血液、尿、淋巴液中。特别是如果放出到血液、淋巴液中，则随着其流动而游遍全身，引起向多个部位转移。由于这样从原发部位放出的癌细胞一般为少数，因此检测上述癌细胞需要高灵敏度的检测方法。使用了核酸扩增方法的检测方法由于一般能够进行高灵敏度的检测，因而适合上述癌细胞的检测。即，可以说使用了核酸扩增方法的存活蛋白mRNA的检测是在广范围的癌症的转移诊断中特别有用的检查方法。

作为一个例子，在胃癌、大肠癌之类的消化道癌症中，为了诊断腹膜转移，用生理盐水清洗腹腔，检查该清洗液中有无癌细胞。如果胃癌等有发展，则癌细胞剥离到腹膜中，在清洗水中确认有癌细胞则为清洗细胞诊断阳性，表示不可能通过手术完全除去癌细胞。该检查通常用显微镜从病理学上进行，但是不看漏癌细胞而将全部的细胞以目视来进行确认存在困难。另外，已知很多根据病理检查的细胞诊断即使是阴性也成为腹膜转移的病例，认为这是看漏了极少数的转移细胞的结果。因此，希望出现高灵敏度地检测清洗水中的癌细胞的方法。认为使用了核酸扩增方法的存活蛋白mRNA的检测在胃癌、大肠癌等全部消化道癌症中能够高灵敏度地进行腹膜转移诊断。

作为其它的例子，已知在膀胱癌中癌细胞剥离到尿中。怀疑是膀胱癌的情况下，一般进行利用细胞诊断和膀胱镜的检查，但是前者存在如上所述的漏诊的问题，后者由于是侵入性的检查，所以存在患者负担大的问题。因此，将尿中的细胞作为检测体的存活蛋白mRNA的测定可以说是弥补细胞诊断和膀胱镜的缺点的检查方法。另外，如果着眼于低侵入性方面，将血液作为检测体的检查也适用，但是使用了核酸扩增方法的存活蛋白mRNA的检测即便是血液检测体也可以在广泛的癌症中以高灵敏度检测癌细胞。

另外作为其它的例子，癌细胞可能剥离到肺癌中的胸水中、肝癌中的腹水中。癌细胞剥离到这样的体液中时，一般成为获知癌症进程的基准。通过使用了核酸扩增方法的存活蛋白mRNA的检测，能够高灵敏度地检测这样的胸水、腹水中有无癌细胞。