[发明专利]分支杆菌的快速检测

说明书

本发明涉及样品中分支杆菌的快速检测方法和其试剂及试剂盒。

作为结核感染(TB)的病原体(aetiological agent)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(M.tuberculosis)是世界范围传染病死亡的主要原因——潜伏感染影响差不多三分之一的世界人口。世界卫生组织(WHO)估计全球每年几乎九百万的新的TB病例和几乎二百万的死亡出现。2005年中最大数量的新的TB病例出现在东南亚(全球34％的新发病例)，并且估计在撒哈拉以南非洲的发病率几乎为每100,000人群中350例病例。

然而，TB感染不限于发展中世界：自从20世纪80年代后期，UK已经观察到结核病的再现，并且目前每年超过8000例的新病例——每100,000人群中14.0例的比例。大约40％的这些新病例出现在伦敦地区，在这里的感染率为每100,000人群中44.8例。高度危险的人群包括一些移民群体、无家可归的人、犯人和问题药物使用者。

TB感染通常通过抗生素的6个月过程可以治疗；然而，患者对药物治疗的依从性改变，当它们的症状停止时患者通常停止治疗。另外，TB比例在移民人群中是高的，使得实行跟进的治疗困难。如果不治疗，活性TB疾病的每个人将在每年平均感染10到15个人之间。WHO认可的综合策略——称为“直接观察治疗短期过程(Directly Observed Therapy Short-course)”(DOTS)是增加药物依从性和减少多药物抗性结核分枝杆菌菌株出现的一种方法。该WHO方法的一方面集中能够进行和促进研究，认识到TB的消除将依赖于新的诊断学、药物和疫苗。

因为最佳的患者管理需要药物治疗的尽早开始和尽可能快地隔离感染的个体，所以在现有技术中存在对快速和可靠的检测技术的需要。

然而，传统的TB感染的诊断方法或是长时间(生物培养)的，或者潜在地缺少灵敏性(抗酸性涂片镜检)。肺外TB的诊断由于使用已知技术获得足够的检测材料的困难性而变得复杂。

更具体地，检测分支杆菌的现有标准方法学需要熟练的技术人员并可能导致多达八周的诊断结果延迟。当前的WHO指导方针推荐具有可疑TB的人提交至少三份痰样品(在分开的场合产生)以增加检测活动性TB的可能性。

为了通过萋-尼染色(Ziehl Neelsen staining)检测痰中的分支杆菌，需要每毫升痰超过5,000个生物以通过光学显微镜看到杆菌。这样，“涂片”试验通常缺少灵敏度和特异性。而且，在患有活动性肺TB的患者中，只有估计的45％的感染通过痰显微镜方法检测到(Dye等人，2005)。

分支杆菌的培养仍然是诊断和药物敏感性测试的金标准，并且可以检测少至每毫升痰10个生物。然而，这种技术由于长的温育时间(多至数周用于诊断)和在野外执行的困难性而受到妨碍(Kent和Kubica，1985)。

结核分支杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)(MTBc)包括五个种：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、牛分支杆菌(M.bovis)、M.canetti和非洲分支杆菌(M.africanum)——它们是全世界范围内大多数结核分枝杆菌感染(TB)病例的病原体。在这些种之间的高水平的DNA序列同一性已经限制了使用DNA序列在MTBc的成员之间进行区分。

由于在诊断分支杆菌学领域中引入核酸扩增分析，所以已经发展了多种室内和商业分析。作为实例，Roche AMPLICOR MTB系统扩增所有分支杆菌共有的16S rRNA基因序列的584-bp区域。

目前检测和分型MTB复合群“MTBc”的分支杆菌的分子方法学包括转座因子IS6110的扩增(Thierry等人，1990；Yuen等人，1995)。然而，基于IS6110的方法具有不佳的再现性和不佳的灵敏度。

在这方面，IS6110的拷贝数在MTBc的成员之间不同，并且似乎是菌株依赖性的(Poulet和Cole，1995)。尽管MTBc的许多成员包含在整个基因组中分散的8-15个拷贝的IS6110，但是大约40％的结核分枝杆菌菌株仅具有该因子的一个或两个拷贝，而牛分支杆菌只包含(平均)单个拷贝。