[发明专利]发现表达连接基因

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，更具体地涉及基因组DNA中核酸序列的测序、检测以及鉴定领域。更加具体地说，本发明涉及一种方法在核苷酸序列的鉴定和/或检测中的应用，其中所述核苷酸序列代表基因组中的大部份转录区及其周围区域，并且涉及多种多样的遗传性状、基因和它们的组合。本发明可以用于高通量检测和鉴定来自任何来源，可以是植物、动物、人、人造物或其他来源的分子标记物的领域。

背景技术

育种技术已从可见性状的简单选择演变成利用分子标记物来检测多基因性状的先进方法。原则上，杂交群体的不同种系之间的每一种遗传差异都能够代表一种改变的性状。然而，由于大多数基因组的复杂性，所以不可能鉴定基因组之间存在的每一种差异并使其关联于特定性状。从理论上讲，对完整的基因组进行测序将揭示基因组之间的所有差异。然而，借助于目前的测序技术，在实践中不可能以时间和成本有效的方式实现上述目的。因此，用于检测遗传差异的方法主要基于复杂度降低的原则，其涉及来自不同个体的有限但完全确定部分的基因组DNA的测序。随着测序技术的发展，对于某些用途如代表所有表达基因序列的转录物组(transcriptome)的分析，复杂度降低已变得不那么重要了。然而，真核基因组的大小(几十至数百的巨碱基(百万碱基，megabase))仍然超过目前高通量测序技术的能力。此外，在真核生物体中，尤其是在那些具有较大基因组的真核生物体中，绝大多数的基因组DNA并不提供对于育种目的有价值的信息，因为它从未被表达，因而对于性状的表达似乎并没有贡献。

因此，为了鉴定分子标记物，集中于那些在更大程度上揭示与性状紧密关联的分子标记物的基因组部分的方法优于仅分析来自包括未表达区域的基因组的随机选择的方法。当基因组大小增加时，这个问题就变得更加突出。所描述的方法使得能够确定代表大部份被表达的基因的编码区的基因组DNA的所选部分以及它们周围区域的序列。不同个体之间的上述所选部分的比较使得能够鉴定在已表达基因内部或附近的多态位点。因为在非编码区中多态性的频率更高，所以当使用目前的技术时能够使更多的多态性与表达基因相关。而且还可以对更多保守基因周围的更大非编码区中的多态性的存在进行分析。这会最终导致发现每种性状的至少一种标记物。本发明的方法使得能够通过启示在不同个体和生物体中、甚至是在具有复杂和较大基因组的生物体中的基因组的明确确定部分而集中于在基因编码区和基因调控区中的SNP检测。

核苷酸序列多态性(如SNP)被广泛用于构造基因组图谱。在称作遗传作图的方法中，在将多态性关联于表型以后，上述多态性能够用作标记物辅助育种技术中的标记物从而检测在发育任何阶段的特定表型。通常在基因组DNA中鉴定核苷酸序列多态性。当所有真核生物体的基因组大小远超过能够利用目前的高通量测序技术来分析的核苷酸的数目时，就需要用于复杂度降低的重复性程序来分析整个基因组的选定部分，从而发现在个体之间的能够用于基因组作图的遗传差异。然而，目前使用的复杂度降低方法的统计特性意味着那些方法并不能揭示可以关联于单一表型的在前的(priori)那些遗传差异或是接近于对特定表型有贡献的基因的图谱。

出于以下几个原因，目前的技术主要集中于发现单核苷酸多态性(SNP)：与任何其他类型的多态性相比，SNP在基因组中存在的频繁更高；SNP能够准确检测纯合等位基因和杂合等位基因；SNP能够应用于高通量用途和许多工业平台，许多工业平台可以在任何所希望的应用规模以较低成本进行SNP检测。

就像密切相关个体的保守基因编码区和基因组一样，虽然SNP发现是在发生低水平多态性的情况下会选择的方法，但是由于固有的低水平多态性，利用在密切相关个体中的SNP发现的EST库并不是那么有效。

总之，SNP发现方法应理想地揭示物理上关联于感兴趣的性状的所有存在SNP，而不应受到较低水平多态性(当它们存在于基因组的基因编码区中时)的阻碍或受到对基因组序列知识的任何要求的阻碍。

因此，需要一种能够可重复地确定基因组DNA区域中的代表大部份的基因编码区和它们周围区域的相伴序列，而不需要使用先前已知的基因组或转录物组序列的方法。

发明内容

本发明的发明人现已发现一种用于分析生物体的基因组区的方法，该方法包括四个主要部分。