[发明专利]发现表达连接基因

权利要求书

1.一种用于鉴定样品中的基因组DNA的方法，包括

从所选生物体分离mRNA并由所述mRNA制备具有一个衔接子的小单链cDNA片段，其中所述衔接子包含亲和标记；

从相同或相关生物体分离基因组DNA并由所述基因组DNA制备连接于衔接子分子的单链基因组DNA片段；

使所述单链基因组DNA片段与所述单链cDNA片段杂交并扩增所述杂交体；以及

对所述杂交体进行高通量测序。

2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：

a)分离和纯化来自生物体组织样品的mRNA；

b)利用所述mRNA作为模板来合成cDNA；

c)可选地使所述cDNA的复杂度降低；

d)所述cDNA的片段化；

e)可选地选择所述片段的大小；

f)可选地通过结合于链霉亲和素包裹的亲和珠除去包含多聚腺苷酸的片段；

g)抛光所述cDNA片段；

h)所述片段与一种包含稀有限制酶的识别位点的衔接子和包含生物素标记的另一种衔接子连接；

i)可选地选择所述片段的大小；

j)所述片段的缺口修复；

k)选择包含两种衔接子序列的所述片段；

l)对步骤h中描述的所述衔接子序列退火，利用引物来扩增所述片段，其中一种引物与具有稀有限制位点的衔接子互补而另一种引物包含生物素标记；

m)使所述片段结合于链霉亲和素包裹的亲和珠；

n)利用来自所述片段的相应的限制酶，除去包含所述稀有限制位点的衔接子；

o)通过生物素-链霉亲和素相互作用，从借助于生物素-链霉亲和素相互作用附着于亲和珠的双链DNA片段除去未附着于亲和珠的单链，从而产生结合于链霉亲和素亲和珠的DNA的单链；

p)分离和纯化例如来自步骤a的生物体的基因组DNA；

q)所述基因组DNA的片段化；

r)可选地抛光所述基因组DNA；

s)所述基因组DNA与一种单一类型的衔接子或与两种不同类型的衔接子(优选的)连接；

t)将所述基因组DNA解链成单链DNA；

u)使来自步骤t)的基因组DNA与来自步骤o)的在珠上的cDNA杂交；

v)通过洗涤除去未结合的基因组DNA；

w)通过聚合酶来延伸所述cDNA-基因组DNA杂交体以产生双链模板；

x)对所述基因组DNA-cDNA杂交体进行PCR；

y)通过大小分级，从所述PCR选择大于约100个碱基对的片段；

z)可选地纯化所述片段；

aa)对所述片段进行高通量测序。

3.一种用于鉴定多态性的方法，包括根据权利要求所述的所有步骤，另外包括：

ab)比较来自两个或更多样品的序列数据以鉴定多态性。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，将来自步骤aa)的序列结合到重叠的单个序列的重叠群中。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，通过自动标注对来自步骤ab)的序列或来自权利要求3的重叠群进行标注。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，序列获自属于一种物种的个体并与可获得的EST数据比较，以揭示非编码序列如内含子序列和基因内部的非编码序列。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，序列获自属于相关物种的一个或多个个体，并与可获得的EST数据比较，以揭示非编码序列如内含子序列和基因内部非编码序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，序列获自属于相同物种的两个或更多个体，并比较以揭示多态位点。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，序列获自不同物种的一个或多个个体，并比较以揭示多态位点。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，序列获自不同物种的一个或多个个体，并比较以揭示基因组DNA中的保守区。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，包含来自步骤h)的稀有限制酶的识别位点的衔接子包含酶SapI的识别位点。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过雾化来实现所述核酸的片段化。