[发明专利]一种检测螺旋霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒有效
申请号: | 200910237822.0 | 申请日: | 2009-11-11 |
公开(公告)号: | CN101839918A | 公开(公告)日: | 2010-09-22 |
发明(设计)人: | 何方洋;万宇平;冯才伟;赵正苗;冯才茂;汪善良;冯静;余厚美;冯月君;罗贵昆 | 申请(专利权)人: | 北京望尔康泰生物技术有限公司;北京望尔生物技术有限公司 |
主分类号: | G01N33/577 | 分类号: | G01N33/577;C07K16/44;C12N5/20 |
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地址: | 102206 北京市昌平*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 螺旋 霉素 方法 及其 专用 免疫 试剂盒 | ||
技术领域
本发明涉及一种检测螺旋霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒。
背景技术
螺旋霉素属于大环内酯类抗生素,对葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌等有抗菌作用。主要用于抗畜禽细菌及支原体感染,亦可作饲料添加剂以促进增重和提高饲料转换率。国际食品法典委员会、欧盟以及日本均规定该药物的最高残留限量值为200μg/L;因此,在实践中,需要一种精确度、灵敏度高的检测螺旋霉素方法。
目前,动物组织中螺旋霉素残留量的常规检测方法主要有杯碟法、高效液相色谱/质谱/质谱法、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱/串联质谱等,但是这些方法存在着检测过程繁琐、仪器设备复杂和对检验人员的技能要求高的缺点,不适合现场监控和大量样本的筛查,推广应用受到限制。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测螺旋霉素的酶联免疫试剂盒。
本发明所提供的检测螺旋霉素的酶联免疫试剂盒,包括螺旋霉素特异性抗体及包被原和酶标记物;所述包被原为螺旋霉素半抗原与载体蛋白的偶联物或抗抗体;所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标螺旋霉素半抗原;当所述包被原为螺旋霉素半抗原与载体蛋白的偶联物时,所述酶标记物为酶标抗抗体;当所述包被原为抗抗体时,所述酶标记物为酶标螺旋霉素半抗原。
为了更方便现场监控和大量样本筛查,所述试剂盒还可包括螺旋霉素标准品溶液、显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。
其中,所述浓缩洗涤液可为pH值为6.2-6.7、含有0.7-1.0%的吐温-20、0.03-0.05‰的叠氮化钠、0.15-0.2mol/L枸橼酸盐缓冲液;所述浓缩复溶液可为含有5-8%的山羊血清、pH值为7.1-7.6、0.3mol/L的巴比妥-氯化钠缓冲液,所述百分含量为重量体积百分含量;当标记酶为辣根过氧化物酶时,所述显色液由显色液A液和显色液B液组成,显色液A液可为过氧化氢或过氧化脲,显色液B液可为邻苯二胺或四甲基联苯胺,终止液可为1-2mol/L硫酸或盐酸溶液;当标记酶为碱性磷酸酶时,显色剂可为硝基磷酸盐缓冲液,终止液可为2mol/L氢氧化钠溶液。
所述螺旋霉素特异性抗体为螺旋霉素多克隆抗体或螺旋霉素单克隆抗体;它们均是以螺旋霉素半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的;所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、兔血清蛋白、血蓝蛋白、纤维蛋白原或卵清蛋白等。
螺旋霉素是小分子物质,只有免疫反应性,没有免疫原性,不能诱发机体产生免疫应答,必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。因此将螺旋霉素与盐酸羟胺反应后再和琥珀酸酐反应得到螺旋霉素半抗原,这样突出了螺旋霉素分子结构中的特征基团,使制备的螺旋霉素抗体对螺旋霉素的特异性很高。其中,螺旋霉素半抗原与载体蛋白的结合比例过低或过高都对免疫不利,螺旋霉素半抗原与所述载体蛋白的摩尔配比为20-23∶1比较合适。
所述螺旋霉素多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体。
所述螺旋霉素单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.3355的对螺旋霉素药物的单克隆抗体杂交瘤细胞株D-1-2分泌产生的抗体。
所述酶标抗抗体是采用过碘酸钠法将所述标记酶与所述抗抗体进行偶联得到的;所述过碘酸钠方法中,所述标记酶与所述抗抗体的摩尔浓度比为2∶1;所述标记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶,优选为辣根过氧化物酶。
所述浓缩洗涤液具体为pH值为6.5、含有0.8%的吐温-20、0.05‰的叠氮化钠、0.2mol/L的枸橼酸盐缓冲液;所述浓缩复溶液为含有6%的山羊血清、pH为7.5、0.3mol/L的巴比妥-氯化钠缓冲液;所述百分含量为重量体积百分含量;所述底物显色液A液为过氧化脲,所述底物显色液B液为四甲基联苯胺;所述终止液为2mol/L的盐酸。
在洗涤液中加入一定量吐温-20和叠氮化钠的作用在于:缓冲液中吐温-20会减少抗体的非特异性吸附,还能对蛋白起到一定的保护作用,加入叠氮化钠后,则叠氮钠在溶液中抑制细菌的生长,对溶液的稳定性起到一个保护作用。
本发明的另一个目的是提供一种检测螺旋霉素的方法。
本发明所提供的检测螺旋霉素的方法,包括以下步骤:
1)样品前处理:
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