[发明专利]检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种检测酱油中转基因大豆成分的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包 含酱油DNA提取试剂和PCR检测引物；

所述酱油DNA提取试剂由溶液I、溶液II、溶液III、溶液IV和溶液V组成； 溶液I为pH 8.0，100mmol/L的三(羟基)氨基甲烷盐酸盐溶液；溶液II为DNA 提取缓冲液，内含pH8.0、20mmol/L的乙二胺四乙酸、500mmol/L的NaCl和 质量体积比为1.5％的十二烷基硫酸钠；溶液III包含质量体积比为2％的十六烷 基三甲基溴化铵和体积百分比为0.2％的β-巯基乙醇；溶液IV为1.5mol/L的盐酸 胍溶液；溶液V为20μg/ml的蛋白酶K溶液；

所述PCR检测引物由检测大豆内标基因的引物与检测转基因外标基因的引 物组成；

所述的转基因外标基因为抗草甘膦基因、CaMV 35S启动子或NOS终止子 中的至少一种；

所述抗草甘膦基因的PCR引物如下：

eps-1：5’-ATGGCTCAAGGGATACAAACC-3’

eps-2：5’-ACCGCCGAACATGAAGGA-3’；

所述CaMV 35S启动子的PCR引物如下：

35S-1：5’-ATTGTGCGTCATCCCTTAC-3’

35S-2：5’-CCGACAGTGGTCCCAAAGA-3’；

所述NOS终止子的PCR引物如下：

NOS-1：5’-CGTCATGGGCCTCGTGTCGG-3’

NOS-2：5’-AGTAACATAGATGACACC-3’。

2.根据权利要求1所述检测酱油中转基因大豆成分的试剂盒，其特征在于： 所述的大豆内标基因为大豆凝集素基因。

3.根据权利要求2所述检测酱油中转基因大豆成分的试剂盒，其特征在于： 所述大豆凝集素的PCR引物如下：

lec-1：5’-TGGTGGAGGCATCATAG-3’

lec-2：5’-ACCCAGAATGTGGTTGTAT-3’。

4.权利要求3所述试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)样品的预处理：酱油与无水乙醇按体积比1∶(3～3.5)混匀，冷却至 -20℃维持10～12分钟，4℃ 10000rpm离心10分钟，弃上清；在沉淀中加入3倍酱 油体积的溶液I，迅速混匀，搅拌1.5～2小时，室温12000rpm离心10分钟，弃上 清；

(2)样品DNA的提取：

A、在步骤(1)所得样品沉淀中加入溶液II、溶液IV和溶液V，溶液II、 溶液IV和溶液V的加入量分别为酱油体积的80/1000～85/1000、10/1000～ 15/1000和8/1000～8.5/1000；再加入预热至65℃的溶液III，溶液III的加入量为酱 油体积的15/1000～20/1000；

B、接着，65℃水浴30分钟，加入与步骤A最终得到的溶液等体积的体积比 为24∶1的氯仿∶异戊醇溶液，4℃振荡10分钟，15000rpm离心10分钟，取上清液， 重复氯仿∶异戊醇溶液抽提步骤至少一次；

C、在上清液中加入2/3上清液体积的异丙醇，于-20℃沉淀DNA 2小时， 6000rpm离心6分钟收集DNA沉淀；加入500～550μl 70％乙醇轻柔漩涡打散DNA 沉淀，6000rpm离心6分钟收集DNA沉淀，再加入300μl无水乙醇洗涤DNA沉淀； 待无水乙醇挥发完全后，将DNA重溶解于20～30μl三羟甲基氨甲烷缓冲液，得 到酱油总DNA；

(3)PCR检测：

PCR反应体系总体积为25μl，其中成分有：

PCR扩增条件如下：预变性：94℃ 5分钟；循环反应：94℃变性30秒，58℃ 退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸8分钟，4℃保存。

5.根据权利要求4所述试剂盒的使用方法，其特征在于：所述水为双蒸水、 三蒸水或超纯水。