[发明专利]重组融合蛋白PTD-MAX及其表达方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及重组融合蛋白技术领域，尤其涉及一种重组融合蛋白PTD-MAX及其表达方法与应用。

背景技术

PAC1受体是垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide，PACAP)的特定受体，参与介导PACAP的多种生物学功能。PACAP是1989年发现的，由脑垂体分泌的或目的组织自分泌和旁分泌的具有重要生物学功能的神经多肽，属于是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。

PACAP的具有3个受体：PAC1是PACAP的特异受体；VPAC1和VPAC2是PACAP和血管活性肠肽(VIP)的共同受体；PACAP对3个受体具有相同的激动功能，其中PAC1受体主要分布于中枢神经系统、周围神经系统以及睾丸、卵巢、呼吸道、肺、胰腺等非神经组织内等。目前已证实由PAC1介导的PACAP生物学功能有：神经递质/调质、保护神经细胞；神经损伤修复(眼角膜敏感度恢复，眼部手术后神经细胞突出形成)；调节血管；促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；参与消化活动，调节能量代谢平衡；参与调节免疫系统；调节细胞增殖分化；与摄食睡眠有关；与学习和记忆有关；与某些心理感受有；与动物的生物钟有关；等等。

从白蛉唾液腺中分离的由61个氨基酸组成的多肽maxadilan是已知的PAC1受体的特异激动剂，研究表明maxadilan通过激活PAC1受体，有效促进神经干细胞的增殖。因此，maxadilan具有预防、治疗如脑中风，脑损伤，帕金森，老年痴呆等神经相关疾病的潜能。

PTD(Protein transduction domain)是最初发现于HIV病毒TAT蛋白中的具有穿膜功能的核心区；由11个氨基酸YGRKKRRQRRR组成，含有8个碱性氨基酸，生理条件下带较高的正电荷，并形成稳定的a螺旋结构。PTD具有强大的运载潜能，能将外源性蛋白质、DNA、RNA、化学药物等转运至细胞内，甚至可以穿越血脑屏障。此过程不受化合物/复合物分子类型和大小的限制，并且对宿主细胞没有显著毒副作用。

目前尚未有人利用PTD的运载功能将maxadilan多肽运送进入靶位点，从而实现相关疾病的治愈，也未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种既可通过血脑屏障和穿细胞膜运输的，又具备maxadilan生物活性的重组融合蛋白PTD-MAX。

本发明的另一个目的是提供上述重组融合蛋白PTD-MAX的表达方法。

本发明的另一个目的是提供上述重组融合蛋白PTD-MAX的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

本发明的重组融合蛋白PTD-MAX是采用常规的基因重组方法制备而得，包括如下步骤：

(1)设计并合成PTD-MAX基因

本发明设计合成3条引物，采用两步PCR方法合成PTD-MAX基因：

引物1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

引物2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

引物3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

上述三条引物中，N代表保护碱基，CATATG为NdeI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点。

两步PCR：首先以现有的maxadilan基因为模板，引物2和3进行第一轮PCR；然后以第一轮PCR产物为模板，以引物1和3为引物，进行第二轮PCR，获得PTD-MAX基因，所述PTD-MAX基因其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

(2)构建重组质粒

用NdeI和XhoI进行酶切，将PTD-MAX基因克隆到质粒中构建重组质粒；

(3)构建表达工程菌

将上述所得重组质粒转化表达大肠杆菌宿主菌，构建表达工程菌；大肠杆菌宿主菌选用E.coli.ER2566。

(4)用诱导剂异丙基-□-D硫代半乳糖苷诱导表达重组目的蛋白；

(5)表达的目的蛋白经几丁质柱纯化，硫醇诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽C端硫酯，多肽C端硫酯水解得到重组融合蛋白PTD-MAX。

本发明的重组融合蛋白PTD-MAX，由78个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。