[发明专利]循环“连接－延伸”基因组测序法

权利要求书

1.循环“连接——延伸”基因组测序法，基于SOLiD测序技术的连接法测序原理， 其特征在于：采用一条测序引物连接一段通用寡核苷酸后，通过延伸一个碱基检测DNA 模板对应位置的碱基信息，然后将标记物从测序引物连接的寡核苷酸中引物末端位置切 割，按照同样的方法再连接相同的寡核苷酸后延伸一个标记单体，依次可以测定DNA模板 上若干间隔位置的碱基信息；将上一完成若干间隔位置碱基序列测定的测序引物通过变性 或消化法清除，更换新测序引物，同样按照“连接-延伸”法测定DNA模板上其它若干间 隔位置的碱基信息；循环更换测序引物，最后将这些测序引物确定的间隔位置碱基信息组 合得到DNA模板某个片段全部碱基的排列信息，实现DNA序列检测；包括以下步骤：

(1)未知序列的DNA模板通过5’端固定到固相载体上，并用测序引物与DNA模板完 成杂交反应；在DNA模板的指导下，通过连接酶的作用将8个碱基的通用寡核苷酸序列与 测序引物完成连接反应；

(2)加入ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP四种单体，分别用不同的荧光对四种单体进 行标记，完成延伸反应；

(3)扫描确定对应模板第一个碱基的信息，使用化学试剂将离标记物从末端第二个碱 基处进行切割反应；

(4)依次按照“连接-延伸”的方法实现DNA模板上若干间隔位置的碱基信息：

1)采用测序引物P1将DNA模板上第9、16、23、30、……位置上的碱基信息确定；

2)然后将测序引物P1从DNA模板中清除变性，再采用测序引物P2将DNA模板上第 8、15、22、29、……位置上的碱基信息确定；

3)依次更换测序引物将DNA模板上其它若干间隔位置的碱基信息确定，其中P8，P9 引物不需要进行连接反应，只需要进行一步延伸反应确定一个碱基的信息，最后将这些碱 基信息全部组合得到DNA模板某个片段全部碱基的排列信息实现DNA序列。