[发明专利]一种检测A群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测A群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸，更具体地说，是一种检 测A群轮状病毒的反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测试剂盒，具体而 言是指利用RT-LAMP原理快速检测A群轮状病毒的寡核苷酸序列、试剂盒和方法， 属生物技术领域。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属。呈球形，直径60～80nm， 双层衣壳，无包膜，负染后在电镜下观察，病毒外形呈车轮状，故名轮状病毒。是双 链RNA病毒，约18550bp，由11个基因片段组成，每个片段含一个开放读码框架， 分别编码6个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5个非结构蛋白 (NSP1-NSP5)。根据轮状病毒内衣壳VP6的抗原性，可将其分为7个组(A～G)。A 群轮状病毒最为常见，于世界范围内流行，是婴幼儿腹泻的主要原因。据统计，A群 轮状病毒每年可导致600,000～800,000儿童死亡，在发展中国家约占因急性胃肠炎住 院病例的30～60％。

此外，轮状病毒作为一种重要的食源性病毒，可通过粪-口途径传播，污染的水 和食物尤其贝类是传播的主要载体。贝类作为滤过性摄食动物，很容易富集病毒。目 前贝类养殖和收获后所使用的净化方法，只对细菌性污染起作用，对病毒无效。另外， 为保持口感鲜嫩，人们喜欢食用生的或半熟的贝类。因此进食生的或者未经适当烹制 的贝类，极易引起病毒性腹泻病的流行和暴发，同时也会给水产业带来巨大的经济损 失。

因此，研究开发针对轮状病毒的快速检测方法，可广泛应用于临床诊断、卫生防 御、食品安全检测以及水产养殖等领域，对保护人民健康，促进我国水产和食品贸易 的发展都具有重要的意义。

以往轮状病毒的检验主要采用电镜观察、分离培养和酶联免疫方法(ELISA)。然 而，由于电镜设备昂贵，检测灵敏度低，在很大程度上限制了其应用；分离培养方法 灵敏度较低，需要特殊培养条件，而且周期长，不适于轮状病毒的快速检测；ELISA 方法操作简便，价格低廉，灵敏度和特异性教高，但是其检测依赖于特异性抗原-抗 体反应，容易受到环境条件和样品中干扰物质的影响。

近年来以核酸扩增为基础的分子生物学技术已成为轮状病毒检测的主要手段，但 仍存在不同的缺陷。如RT-PCR，通常需要4～5个小时，检测结果需要通过核酸电泳、 紫外观察，不但容易造成对环境的交叉污染，对操作人员也具有一定的毒性作用。实 时荧光RT-PCR因其灵敏度高、特异性强、可用于定量检测而倍受欢迎，但同时也对 仪器设备和操作人员的技术条件提出了更高的要求，而且试验中所用试剂和探针等费 用较为昂贵，这些都为轮状病毒检测的广泛开展带来了一定的困难。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是2000年 由Notomi等人开发的一种新颖的核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6～8个区域 设计4～6种特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在等温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。该 方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，亦不需 要精密的仪器与昂贵的检测试剂。因其操作简单、结果直观、灵敏度高、特异性强， 已被广泛地应用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断。近年来我国已开始着手于 致病性细菌的LAMP检测技术研究，如结核分支杆菌、痢疾志贺氏菌、大肠艾希氏菌、 肺炎链球菌、耶氏菌以及食品中常见的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李 斯特氏菌以及副溶血性弧菌等，取得了显著的成效；而针对病毒的LAMP检测主要见 于国外的部分报道，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、腺病毒等DNA病 毒以及流感病毒、SARS冠状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、西尼 罗河病毒等RNA病毒。目前国内外均未见利用RT-LAMP技术对轮状病毒进行检测的 相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测A群轮状病 毒的RT-LAMP寡核苷酸。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的A群轮状病毒 RT-LAMP快速检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：