[发明专利]一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因组学和分子生物学中有机生物分子领域，具体而言涉 及HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法。

背景技术

自然界大多数生物体的遗传信息均包含在脱氧核糖核酸(DNA)中，人 类全基因组中30亿个碱基，约4万个基因，分布在23对染色体上。每个 基因通过转录、翻译，编码特异的蛋白质，调控生物体内特定的生化反应， 发挥特异的生物学功能。DNA序列的改变，即基因突变，会导致蛋白质结 构、功能的改变或缺失，进而引起相关的遗传疾病。基因突变包括DNA分 子中发生碱基对的插入、缺失和改变(点突变)。

研究表明许多疾病的发生，如血友病、地中海贫血、杜氏型肌营养不 良、亨廷顿舞蹈症、老年痴呆症、糖尿病、肥胖症、心血管疾病以及自身 免疫等3000多个疾病与基因突变密切相关。另外，近年来人们逐渐认识 到癌症的发生发展也是基因累积突变的结果。

在人类基因组中，约90％的差异是以单个核苷酸的差异体现出来的， 主要由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，这样 的差异位点称作单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP)。在人群中，这种变异的发生频率至少要大于1％，否则被认为是点 突变。SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表现形式，并且 在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计 其总数可达300万个甚至更多。这些差异极有可能是造成个体差异的遗传 因素，因此发现这些位点可广泛地应用于遗传标记的研究、评估个体遗传 关系、评估物种进化等研究领域。

目前检测SNP和基因突变的方法有许多种，如直接PCR测序、RFLP、 基因芯片和荧光定量PCR等。其中，直接PCR测序最不敏感，只有耐药突 变株达到20％以上才能被检测到；也不适用于大规模筛选；RFLP分析只 能检测出在病毒总体中大于5％的突变株，但是对于每个感兴趣的突变， 必须特别设计单独的核酸内切酶。针对某些突变的特异性内切酶可能并不 存在，因此RFLP分析并不适用于所有的突变。基因芯片技术利用寡核苷 酸微点阵，可以检测新发现的突变，但这种方法代价昂贵，没有得到广泛 应用。总之，上述这些方法不是费时费力，灵敏度低，准确度低，就是成 本高，不适合大规模筛查。

乙型肝炎病毒(HBV)及其基因

全球有超过350万人患有慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，每年由于感 染HBV死亡的人数有50万到120万，而约有75％的乙肝患者在亚洲。我国 是HBV感染高发区，因此对乙肝的治疗刻不容缓。

乙肝病毒是一种易高度变异的病毒，在其逆转录复制过程中因RNA 聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能，可发生一个或多个核苷酸的变异。 HBV-DNA可以在慢性持续性感染过程中自然变异，也可以在免疫压力下发 生变异，甚至在各种抗病毒治疗药物诱导下变异。近年来，核苷类药物已 成为乙型肝炎治疗的主要方法之一，目前最常用的核苷类药物是拉米夫定 (LAM)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(ENT)和替比夫定(LdT)。由于HBV 病毒复制能力极强，因此也极易产生耐药，而一旦耐药可能会有爆发性肝 炎的危险。因此对这四种核苷类药物耐药突变的检测应该有更加重要的临 床意义。

HBV基因的核苷酸突变位点的质谱检测

目前本领域中已有使用质谱分析进行核苷酸突变位点检测的方法，但 是在现有的方法中通常只是针对单个突变基因型进行检测，即每次质谱仅 能检测单个位点的单个突变型。由于质谱分析成本较高，而HBV基因的突 变位点及突变形式又比较多，所以进行多位点和多突变型的检测方法成本 很高，操作程序也相应地繁琐复杂，费时费力。

因此，本领域中亟需新的检测HBV基因的核苷酸突变位点的方法，从 而实现对HBV基因的多个核苷酸突变位点和突变型的快速而简便的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法， 旨在解决现有HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法效率较低而成本较高 的问题。

在本发明的第一方面，提供了一种HBV病毒的核苷酸突变位点的检测 方法，包括如下步骤：

(1)针对待检核苷酸序列的突变位点，并确定突变位点在待检序列中 的位置；