[发明专利]卷烟烟气体外微核检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及卷烟毒性检测方法，尤其是一种卷烟烟气冷凝物体外微核试验方法。

背景技术

微核是细胞的染色体发生断裂后，细胞进入下一次分裂时，染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞浆中形成直径小于主核的1/3的，嗜色与主核一致，完全与主核分开的圆形或椭圆形微小核。微核测定是一种简便快速的细胞遗传学检查方法，在诊断、预防肝癌、食管癌、肺癌等恶性肿瘤，评价药物、放射线及吸烟等细胞毒性物质对人、动物及体外细胞损伤程度有重要意义。

1923年，Taylor C.V.首次发现了微核，并阐述了微核的意义。随后，各研究机构开始开展一系列微核试验进行染色体完整性改变和染色体分离改变的研究。一般采用的实验动物为大鼠和小鼠，但以小鼠居多。采用小鼠骨髓细胞微核试验，小鼠染毒一定时间后，处死，取胸骨，随后将骨髓挤于清洁载玻片上，推片、固定、染色及计数，求出1000个骨髓细胞产生的微核数。另有采用小鼠股骨骨髓进行微核试验。

而我国微核试验创建于20世纪70年代中期，目前许多国家和国际组织，已将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理安全性评价的必做试验。

1976年，maier P.采用10种诱突变物质进行小鼠骨髓微核试验及中国仓鼠成纤维细胞(Chinese hamster fibroblasts)体外微核试验，是体内体外相结合综合研究，这是首次进行的体外微核试验。受试细胞包括外周血淋巴细胞、中国仓鼠肺细胞、中国仓鼠卵巢细胞、人宫颈癌细胞、肝癌细胞等。细胞培养到一定浓度时，加入受试物培养一段时间后，染色，计数产生微核的细胞数。

关于卷烟烟气的微核试验则起始与1988年，Balansky等人选用BDF1小鼠，雌雄各半，置于含600cm²的卷烟烟气的14L玻璃舱内，暴露24h后，取小鼠骨髓，固定染色后，计数小鼠骨髓多染红细胞内的微核数，并比较多染红细胞与正染红细胞的比率。随后，国内卷烟烟气的微核试验一直采用体内试验方法。而体内试验需要大量的动物，并且收集骨髓细胞工作量大，动物福利要求高，耗资大。而体外微核试验可以获得与体内微核试验结果的一致性，并且敏感性、特异性和准确性都与体内微核实验相当，而且在获得细胞微核率的基础上，还可以分析微核的来源。

本案申请人也申请了一种名为《评价卷烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法》专利，其申请号为200810049452.3，是采用周围血进行观察的体内微核试验，并且是以经消化道染毒的方式来考察卷烟烟气的染色体完整性及染色体分离的改变，染毒方式与实际暴露卷烟烟气途径不一致，试验过程复杂，并且受试物的浓度不易控制。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的问题而专门研制的一种卷烟烟气体外微核检测方法，采用体外微核试验，来进行卷烟烟气对细胞染色体畸变的评价，可以降低实验成本，缩短试验时间，获得更为丰富的实验结果。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：卷烟烟气体外微核检测方法，其特征在于：选用中国仓鼠卵巢细胞进行体外微核试验，通过细胞培养、卷烟烟气冷凝物制备、细胞染毒、固定、染色后，测定细胞微核发生率。

其具体步骤如下：

1)细胞培养

中国仓鼠卵巢细胞复苏之后，接种到25mL细胞培养瓶，在二氧化碳培养箱培养24h，待细胞繁殖到5.0×10⁵-1.0×10⁶个/瓶，消化细胞并传至足够的培养瓶中继续培养，至细胞浓度达到所需浓度；

2)卷烟烟气冷凝物制备

标准卷烟抽吸条件下，用二甲基亚砜DMSO萃取烟气冷凝物CSC，用细胞培养基将卷烟烟气冷凝物稀释至不同剂量，保证至少有4个非0的浓度，并配制新鲜的S9(大鼠肝微粒体酶)混合液；

3)细胞染毒

传代后的细胞培养24h后，吸出原有培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗1-2遍后，然后将不同剂量的CSC加入到培养瓶，每个剂量为2个培养瓶，需要活化的另加入S9混合液，继续于二氧化碳培养箱培养27h；

4)吖啶橙染色

培养结束后，将用胰蛋白酶将贴壁生长的细胞脱离细胞瓶底，进行玻片涂片，用固定液(冰醋酸∶甲醇为1∶3)对细胞进行固定。然后用吖啶橙染剂染色5min，冲洗染色剂，晾干玻片；

5)微核计数及计算微核发生率

在显微镜下观察微核，并计数，每个培养瓶细胞计数1000个含微核的细胞数，即每个剂量计数2000个细胞的微核发生率。