[发明专利]一种制备重组人PDCD5的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种制备具有促进细胞凋亡活性的重组人PDCD5(programmed cell death 5)的方法。

背景技术

PDCD5是北京大学医学部在国际上首先发现的新的程序性细胞死亡相关基因，编码125个氨基酸的蛋白质。1999年在国际杂志发表论文时曾命名为TFAR19(TF-1cell apoptosis related gene 19)，2002年国际人类基因命名委员会将其统一命名为PDCD5。研究证明，PDCD5是一个新的抑癌基因，在多种肿瘤中表达下调，通过结合组蛋白乙酰转移酶Tip60发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用。动物实验证明重组人PDCD5蛋白对肿瘤的的化疗具有明显的增敏效应，其本身未发现毒副作用。

中国专利公开号CN1218833A公开的发明专利申请“具有细胞凋亡促进活性的多肽”，涉及PDCD5的制备，重组PDCD5为包涵体形式的原核融合表达，通过变性溶解和稀释复性后，酶解释放出目的蛋白，再用阴离子交换柱DEAE分离纯化。中国专利公开号CN101214371A公开的“人重组蛋白PDCD5在制备肿瘤化疗增敏药中的应用”，重组PDCD5为原核可溶性表达，目的蛋白PDCD5的表达量仅占菌体可溶性蛋白的8％，在小试水平经离子交换和疏水2步层析，目的蛋白电泳纯度大于95％。上述2个专利中均未涉及重要纯化参数如pH、离子强度和纯化评价指标如收率等的描述。大肠杆菌采用可溶性表达形式表达重组蛋白可以避免目的蛋白的变复性过程，但菌体破碎液中目的蛋白混杂了大量的可溶性菌体蛋白，给后续目的蛋白的分离纯化带来了很大的困难，特别在工业化高密度发酵纯化生产时。本发明主要体现在，宿主细胞经流加-批式高密度发酵，菌体密度和目的蛋白表达量提高；通过调节菌液或细胞破碎液的pH至酸性，可以沉淀大部分的杂蛋白，方便了后续的层析分离，而不影响目的蛋白的活性和收率；在层析分离精制时选用阴离子、阳离子或疏水作用介质的任意2种介质组合，目的蛋白的纯度和收率可分别达到99％和70％以上；且本工艺可放大至中试生产。

发明内容

本发明的目的是，提供一种制备基因重组人PDCD5的方法，该方法不仅使重组人PDCD5的表达量高，而且产率和纯度高，并可放大中试生产。

本发明的技术方案是：表达重组人PDCD5的基因工程菌流加-批式高密度发酵、工程菌破碎、目的蛋白粗提、层析分离精制。

重组人PDCD5工程菌流加-批式高密度发酵的方法为：

将表达重组人PDCD5的工程菌接种于摇瓶中的LB、2×YT、SOB或SOC培养基，置30-37℃振摇过夜。将菌液接种于发酵罐中继续培养。自动控制温度于37℃，用氨水自动流加控制pH于6.8-7.1。发酵初期通过增加通气量、通氧量和逐渐增加转速维持溶氧饱和度于20％-50％。至溶氧明显上升时开始流加氮元和碳元，氮元包括酵母提取物、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白水解物等，碳元包括葡萄糖、蔗糖等，流加速度参考溶氧、菌体密度OD₆₀₀值和尾气分析。至OD₆₀₀达70-90时加入诱导剂IPTG，终浓度控制在0.05-0.35mmol/L。继续流加培养3-6小时，至OD开始下降、溶氧上升、OUR和CER下降时结束发酵，此时菌体密度OD₆₀₀平均达120左右。离心发酵液收集菌体。

表达重组人PDCD5工程菌的破碎和重组人PDCD5粗提的方法为：

用1∶2至1∶10(体积比，如无特殊说明，以下同)的去离子水重悬离心沉淀的菌体，用盐酸、硫酸或磷酸调节菌液pH至1.5-5.0，优选pH 1.5-4.0，首选pH 2.0-3.0，匀质机破碎。先在30-50Mpa压力下预破碎菌体一次，然后在100～130Mpa压力下破碎2-3次。离心，10000rpm，20min，收集含重组人PDCD5的上清液。

或用1∶2至1∶10的去离子水重悬离心沉淀的菌体，匀质机破碎。先在30-50Mpa压力下预破碎菌体一次，然后在100～130Mpa压力下破碎2-3次。用盐酸、硫酸或磷酸调节菌体破碎液pH至1.5-5.0，优选pH 1.5-4.0，首选pH 2.0-3.0，离心，10000rpm，20min，收集含重组人PDCD5的上清液。

将离心收集的含重组人PDCD5上清液的pH调至6.0-8.0，优选6.5-7.5，首选6.8-7.2，进一步沉淀部分杂蛋白，上清液SDS-PAGE电泳重组人PDCD5的含量为50-60％。

重组人PDCD5层析分离的方法为：