[发明专利]检测铜绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因芯片及包含该芯片的检测用试剂盒，尤其是涉及一种检测铜绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片及检测用试剂盒。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是革兰氏阴性非发酵机会致病菌，其易于在外界生长繁殖，分布广泛、耐药性强、传播途径多样，成为当今医院感染最常见的病原菌之一。重症监护区的感染10％与铜绿假单胞菌有关，铜绿假单胞菌引起的肺炎、败血症显示很高的发病率与死亡率。近年来，铜绿假单胞菌对抗生素的耐药率逐年增高，多重耐药铜绿假单胞菌的检出率也越来越高。

铜绿假单胞菌可通过获得性抗性或内在抗性对抗生素产生耐药性。其中获得性抗性可通过质粒、整合子、转座子等移动元件在在同种或不同种属之间进行基因的水平转移，从而导致细菌耐药性的传播。因此对获得性耐药菌株的监控对于控制耐药基因传播及预防传染病大爆发有积极意义。

铜绿假单胞菌可获得多种抗性基因，如β-内酰胺酶类基因(tem，shv，oxa，veb，imp，vim)，氨基糖苷修饰酶基因(aac，aad，aph)。前者可导致细菌对β-内酰胺类抗生素抗性，后者可导致细菌对氨基糖苷类抗生素抗性，而此二类抗生素都是目前临床治疗铜绿假单胞菌感染的主要药物。据我国临床检测数据，铜绿假单胞菌常见的重要耐药基因有tem，carb，oxa group I，oxa groupII，imp，aac(3’)-I，aac(3’)-II，aac(6’)-Ib，aac(6’)-II，aadB等.

对各类抗生素耐药基因进行检测鉴定，能更准确地对细菌耐药性进行监测并有助于合理选用抗菌药物，提高耐药菌感染的治愈率。

一般检测耐药性的方法有：药敏试验、Southern blot，PCR，RT-PCR，基因芯片等方法。传统的药敏试验耗时长(3天)，只能判断出耐药表型，无法检测具体耐药原理；普通PCR及RT-PCR特异性高，但检测通量极其有限；Southern blot操作步骤繁琐；基因芯片基于PCR技术，但比PCR更特异灵敏，且具有快速、高通量的优点，十分适用于对多重耐药菌进行相关耐药基因的检测。

德国的Weile Jan等(DNA microarray for genotyping multidrug-resistantPseudomonas aeruginosa clinical isolates，2007，Diagnostic Microbiology andInfectious Disease)利用基因芯片对97株多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株进行了基因分型，结果表明该基因芯片速度快(5h)，准确率高达87.8％)。但该芯片造价较高，每个样品检测成本约50美元，每个靶基因只设计了一个探针，容易产生假阳性。

目前，国内尚未有针对铜绿假单胞菌耐药基因的检测芯片的文献报道或发明专利。

发明内容

为了提高检测速度与精确性，降低成本，更加适于实际应用，本发明提供了一种针对铜绿假单胞菌中常见的重要耐药基因的检测芯片及其试剂盒。

本发明所述的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种：

1)从carb、tem、imp、oxa groupI、oxa groupII、aac(3’)-I、aac(3’)-II、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II、aadB基因和细菌16S rRNA基因中所选取的至少一种DNA片段；

2)从上述1)中选取的至少一种DNA片段的互补DNA片段。

本发明的优选实施例中，所述寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：29所示的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：29所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列相同的序列，具体的优选序列及功能见表1。

本发明所述的基因芯片用于铜绿假单胞菌耐药基因carb、tem、，imp、oxa groupI、oxa groupII、aadB、aac(3’)-I、aac(3’)-II、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II中至少一种的检测。

本发明还提供使用上述的基因芯片检测耐药基因的方法，其主要包含步骤：

1)根据铜绿假单胞菌的耐药基因设计并制备出用于PCR扩增的引物；

2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1)中的引物，按一定浓度混合，对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化PCR产物，制得靶序列；