[发明专利]利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种发酵木糖产燃料乙醇的方法，具体地是一种利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法。

背景技术

木质纤维素是一种非均相聚合糖和木质素的复合物，主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。三者各占的比例随植物的不同部分而有所区别，大概的比例为：纤维素占：40-50％，半纤维素占25-30％，木质素占10-20％(Nancy H，et al，1998)。其中天然半纤维素水解产物的85-90％是木糖，如果植物纤维素中的木糖亦能通过发酵生产乙醇，则能使木质纤维素原料乙醇发酵的产量在原有基础之上增加25％。因此，木糖是否被高效利用是决定木质纤维素资源利用经济性的关键因素。

许多微生物可以木糖为碳源，但仅有少数细菌、酵母菌和真菌可发酵木糖产乙醇。但这些天然菌株也存在一些缺点，例如：乙醇得率较低，对水解物中低浓度抑制物敏感，乙醇耐受性低等。另一方面，高产乙醇的菌株如酿酒酵母、运动发酵单胞菌等，其可利用碳源范围往往有限，一般不能利用木糖。因此，人们试图通过基因工程手段构建新的重组菌，使其高效发酵木质纤维素水解液组分(包括木糖和葡萄糖)产醇。

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)为微好氧菌，可在好氧和厌氧条件下生长，但更喜欢在厌氧条件代谢产醇。运动发酵单胞菌是目前唯一一种通过ED途径厌氧发酵葡萄糖的微生物，与酵母菌相比，运动发酵单胞菌的优点在于：具有更高的糖吸收量和乙醇产量；生物量产量低；乙醇耐受性高；发酵无需氧气；易于遗传操作等(Jeffries，2005)。但其底物范围窄，只能发酵葡萄糖、果糖和蔗糖，不能利用木糖。独特的代谢途径及其所具有的优点使其成为构建产乙醇工程菌的首选宿主之一。

近年来，通过基因工程手段来改造Z.mobilis使之能代谢木糖的研究已受到越来越多人的关注。Zhang等在1995年首次将与木糖代谢相关的4个基因转化到运动发酵单胞菌中，并且成功表达。获得的重组菌株CP4(pZB5)可在以木糖为唯一碳源的培养基上生长，乙醇产量达到了理论量的30％(Zhang etal，1995)；Mohagheghi等将发酵木糖和阿拉伯糖所需的7个基因整合到运动发酵单胞菌染色体上的特异位点-乳酸脱氢酶基因(ldh)中，获得了一株稳定的重组菌AX101，在赋予新菌株发酵利用木糖和阿拉伯糖能力的同时，也减少了副产物乳酸的生成(Mohagheghi et al，2002)；2002年，Lawford等对重组Z.mobilis AX101的木糖、葡萄糖和阿拉伯糖的混合糖发酵进行了分析，结果表明：与乙醇相比，乙酸对生长的抑制作用更大；乙醇会加速乙酸对戊糖利用的抑制；乙酸和乙醇对戊糖的利用具有同样的影响(Lawford and Rousseau，2002)。

上述改造Z.mobilis使之能够发酵木糖的总体思路是：在运动发酵单胞菌中高效表达木糖代谢相关的4个基因：糖异构酶基因(xylA)和木酮糖激酶基因(xylB)负责将木糖转化成磷酸戊糖途径的重要中间物——木酮糖-5-磷酸，转酮醇酶基因(tktA)和转醛醇酶基因(talB)负责将木酮糖-5-磷酸通过磷酸戊糖途径转化成ED途径的中间物再进入ED途径生成丙酮酸，其间转换步骤冗长，牵涉的基因亦很多，进而造成发酵木糖产乙醇的效率不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法，以克服背景技术中的不足之处。

为实现上述目的，本发明提供的利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法，主要步骤为：

A)将重组运动发酵单胞菌接种到卡那霉素或氨苄青霉素的T液体培养液中，于20-30℃下培养至OD₆₀₀＝1.0时，取上清液；

B)将上清液加入水后收集馏出液，用气相色谱测定乙醇浓度。

步骤A所述T液体培养液为100mL内含30-50μg·mL^-1的卡那霉素或氨苄青霉素。