[发明专利]可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及寡核苷酸探针制备领域，尤其涉及一种可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法。 

背景技术

2002年，荷兰科学家发明了一种名为多重连接扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)的高通量的基因检测方法，该技术利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应，可以在同一反应管内对多达45种不同的核苷酸序列进行检测和定量分析。该技术仅需20ng/μl DNA，即可通过简单的杂合、连接、PCR扩增及电泳步骤，在同一反应管中对多个不同的靶基因进行检测和定量分析。 

MLPA技术原理示意图见图1，该技术主要包括：探针与靶序列的杂交、探针的特异化连接、连接探针的扩增和结果的检测分析。针对每一个待测靶基因序列，均有一对MLPA探针，其由一个短的寡核苷酸片段(短探针)和一个长的寡核苷酸片段(长探针)组成。该技术的特色之一是仅扩增连接完好的探针，而不是扩增样本靶序列。该技术的扩增环节仅需2条引物，一是引物GP1，另一是引物GP2。在所有短探针的5’端均有一段共同序列，该序列与引物GP1的核酸序列相同；在所有长探针的3’端均有一段共同序列，该序列与引物GP2的核酸序列互补。可见，所有连接探针的PCR扩增用的是同一对引物。若两探针连接，则扩增可进行；而若两探针未连接，则扩增无法进行。各长探针在共同序列和与靶序列互补的序列间有不同长度的填充片段，该片段长度不同使连接后的MLPA探针长度不同，故其扩增片段长度亦不同。一般相临两产物的长度相差6～8bp，因此可同时检测基因组的多种不同靶基因。扩增后进行结果检测分析比对，得出结论。 

至今MLPA技术已应用于多种领域的研究及基因诊断，如单核苷酸多态性(SNP)和基因突变检测、染色体数目异常、遗传疾病基因缺失重复、基因甲基化检测、抑癌基因诊断及mRNA分析等。由于MLPA操作简便、成本低廉、应用领域广，这几年来，已超过有上百篇的研究报告发表。 

在该方法中涉及到长探针和短探针，其中探针的设计是难点，荷兰科学家创造性地利用了M13单链噬菌体的特性，巧妙地在插入衍生的序列两端设计了限制性内切酶(RE)识别位点，以便采用双酶切获得长探针，克服了目前寡核苷酸合成一般难以达到50mer以上的困难。但该方法至少有2大缺陷：1)相对于极其庞大的有分子生物学检测需要的实验室来说，能够培养M13噬菌体的实验室不多，只能求助于收费高昂的商业化生产，成本极高；2)周期长，设计难度大。 

发明内容

为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法，该方法设计容易、操作简单、所需实验室设备少。 

为达到上述目的，本发明采用PCR方法结合亲和素磁珠法制备可用于多重连接扩增技术的长探针，本发明所述可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法英文名称为long oligonucleotide preparation bymagnetic-beads，缩写为LOPM。 

所述可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法包括以下步骤： 

1)针对目标核苷酸序列和用于制备长探针的与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列设计一对PCR扩增引物，分别为通用引物和检测引物； 

2)在通用引物的5’端标记生物素； 

3)以所述与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列为模板进行PCR扩增，获得生物素标记的双链核苷酸序列； 

4)将所述生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素标记的亲和素磁珠混合，使生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素磁珠相互吸附； 

5)使生物素标记的双链核苷酸序列变性，解链形成单链； 

6)离心，取上清，获得非生物素标记的单链核苷酸序列。 

所述检测引物由两段核苷酸序列组成，一段根据目标核苷酸序列设计，另一段根据与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列设计。 

步骤4)所述PCR扩增得到的生物素标记的双链核苷酸序列经先经过纯化后再与亲和素磁珠混合。 

所述每1份重量份生物素标记的双链核苷酸序列与10份重量份的亲和素磁珠混合。 

所述生物素标记的双链核苷酸序列加热变性或者在碱性条件下变性。 

所述步骤6)的离心条件为4℃，10,000rpm，离心30sec。