[发明专利]O157:H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及O157:H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及检测方法。 

(二)背景技术

新发现和重新抬头的病原微生物是当前世界医学面临的新课题，肠出血性大肠菌O157:H7就是其中的一种。O157:H7是肠出血性大肠艾希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)最主要的血清型，于1982年首次在美国发现，为新发病原菌。其致病性强，感染剂量极低，食入不足10个细菌即可引起疾病。该菌主要引起出血性肠炎(HC)、溶血性尿毒综合症(HCS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，病死率高达30％以上，是全球关注的世界性公共卫生问题。我国自1988年在江苏徐州检出首株EHEC O157:H7后，各地加强了对肠道门诊、畜禽及肉制品等的食品检测，相继从腹泻病人、家畜、家禽及食品中多次检出O157:H7大肠菌。通过对近几年我省O157分离株毒力基因检测(PCR法)发现我省主要以Stx2为主，同时携带Stx2和Stx1基因的菌株则比较少，这与国内其他省市分离出的大多数菌株相似，但与Fagan等报道则不同，故本研究主要选取stx2基因为靶基因进行检测。rfbE与fliC基因分别编码O157:H7菌体抗原O抗原及鞭毛抗原H抗原，针对这两种基因的检测将有助于O157:H7血清型诊断的进一步验证。 

目前，大多数基层实验室鉴定O157:H7大肠菌仍主要依赖于传统培养方法、生化和血清学鉴定方法，检验方法繁琐，费时费力，报告检验结 果时间长，难以适应快速检测的要求。近年来，PCR法检测O157:H7大肠菌得到了迅速发展，主要有常规PCR、多重PCR、Real-time PCR等，但这些方法均需特殊的仪器，不适合在基层或小型实验室推广使用。Notomi等是2000年开发出的一种新的DNA环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，因其具有操作简便易行、结果判读简单等特点，可以在基层实验室推广使用，该方法已在一些国家地区被广泛应用，而国内对此技术研究则刚刚起步，应用LAMP技术检测O157:H7大肠菌目前未见文献报道。 

环介导等温扩增技术原理：环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术是Notomi等2000年开发出的一种新的DNA环介导的恒温扩增法，即利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的4-6条引物，特异地识别靶序列上的6个特定区域，在60～65℃等温条件下高效特异地扩增目的靶基因，终产物是具有与目的靶基因反相重复序列的茎环DNA。如果再设计1-2条环引物，则可大大提高扩增反应速度。该方法的一大特点是，可以通过反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在，抑或在体系中加入荧光染色试剂，在紫外灯下观察，对反应产物实时监测。 

(三)发明内容

本发明就是根据上述原理，针对O157:H7的O抗原编码rfbE、志贺样毒素stx2、H鞭毛抗原编码flic基因分别设计LAMP引物，提供一种特异性强、灵敏度高的O157:H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及检测方法。 

本发明采用的技术方案是： 

O157:H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒，主要包括特异 性扩增引物、Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸混合物、PCR缓冲液，所述特异性扩增引物序列如下： 

rfbE FIP(O抗原编码rfbE特异性扩增内引物FIP)： 

CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT； 

rfbE BIP(O抗原编码rfbE特异性扩增内引物BIP)： 

TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT； 

rfbE F3(O抗原编码rfbE特异性扩增外引物F3)： 

AACAGTCTTGTACAAGTCCA； 

rfbE B3(O抗原编码rfbE特异性扩增外引物B3)： 

GGTGCTTTTGATATTTTTCCG； 

rfbE LB(O抗原编码rfbE特异性扩增环引物LB)： 

CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC； 

stx2FIP(志贺样毒素stx2特异性扩增内引物FIP)： 

GGTTAATAACAGACACCGATGTGG-ACAGAGATATCGACCCCT；