[发明专利]一种花脸蘑蛋白LsAPI及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物农药，具体涉及一种花脸蘑蛋白LsAPI及其制备方法和应 用。

背景技术

植物病毒病是仅次于真菌病的病害，每年给农业生产造成严重损失，如全 球每年仅烟草花叶病毒(简称TMV)所造成的损失就可达1亿美元，目前对于 烟草花叶病毒还没有有效的防治方法。

食用菌含有的蛋白种类多样，不仅营养丰富，而且还含有许多活性物质， 对于提高人体免疫力、防癌、抗癌都有一定的作用。目前有关食用菌中抗病毒 活性物质的研究主要集中于抗动物病毒方面，在抗植物病毒方面的研究很少。

花脸蘑(Lepista sordida)，属担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲 (Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales)，口蘑科(Tricholomataceae)，香蘑 属(Lepista)。其子实体一般中等大小；幼嫩时其菌盖稍上凸，呈钟状，成熟的 子实体菌盖呈平展状态。花脸蘑蛋白质含量丰富，粗蛋白含量为40.5％，且氨 基酸组成比较齐全。但是其人工培养较困难。在我国，野生花脸蘑的分布较广， 在黑龙江，河北，河南，甘肃，青海，四川，新疆，西藏，内蒙古，广西，云 南，湖南，福建均有分布。专利申请《花脸蘑提取物以及它的制备方法与应用》 (200810223439.5)公开了一种花脸蘑提取物和花脸蘑蛋白提取物，以及它们 在防治烟草花叶病毒病上的应用，但是并没有明确具体的活性物质，因此，有 待进一步的研究和探索。

发明内容

本发明目的是提供一种抗植物病毒的花脸蘑蛋白LsAPI。

本发明另一个目的是提供上述花脸蘑蛋白LsAPI的制备方法。

本发明第三个目的是提供上述花脸蘑蛋白LsAPI在防治烟草花叶病毒病上 的应用。

实现本发明的技术方案如下：

本发明一种抗植物病毒的花脸蘑蛋白LsAPI，所述花脸蘑蛋白来自花脸蘑 (Lepista sordida)，其N端氨基酸序列为：ATVSFFAGADCTGRN(SEQ ID No：1)。

上述花脸蘑蛋白LsAPI，按照如下方法制备：

(1)、将花脸蘑子实体粉末加入0.01～0.05mol/L、pH6.0～9.0的磷酸缓 冲液中浸泡1～3h，然后离心，收集上清液；

(2)、向步骤(1)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为50％，在0～6℃下 放置6～16h，然后离心，收集上清液；

(3)、向步骤(2)所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，在0～6 ℃下放置6～16h，然后离心，收集沉淀；

(4)、用0.1～0.3mol/L、pH为6.0～9.0的磷酸缓冲液溶解步骤(3)所 得沉淀，然后经1～3倍重量的重蒸馏水透析8～16小时，将透析得到的透析液 分别用3KD和30KD的超滤管进行超滤截留，留取分子量为9～90KD之间的蛋白 溶液；

(5)步骤(4)所得蛋白溶液经阴离子交换柱分离，用0.02mol/L、pH8.0 的Tris-HCl洗脱，收集洗脱液，该洗脱液中所含物质即为花脸蘑蛋白LsAPI。

按照通用的命名法，将上述所得花脸蘑蛋白命名为LsAPI(Lepista Sordida Antivirus Protein)。

上述花脸蘑蛋白LsAPI步骤(1)中所述的花脸蘑菌丝干粉与磷酸缓冲液之 间的比例为1g∶10～25ml。

上述花脸蘑蛋白LsAPI步骤(1)中所述的磷酸缓冲液的pH值优选为8.0。

上述花脸蘑蛋白LsAPI步骤(1)、(2)或步骤(3)中所述的离心的速度为 10000rpm。

上述花脸蘑蛋白LsAPI步骤(1)、(2)或步骤(3)中所述的离心的时间为 25min。

所述的花脸蘑菌丝干粉可于市场上购买得到。

上述花脸蘑蛋白LsAPI的制备方法，包括如下步骤：

(1)、将花脸蘑子实体粉末加入0.01～0.05mol/L，pH6.0～9.0的磷酸缓 冲液中浸泡1～3h，然后离心，收集上清液；

(2)、向步骤(1)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为50％，在0～6℃下 放置6～16h，然后离心，收集上清液；