[发明专利]戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用。

背景技术

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的一种急性、自限性病毒性肝炎，主要经粪-口途径传播。临床表现类似甲型肝炎，但黄疸较为常见，孕妇感染后病情通常较重，死亡率达20％。我国是戊型肝炎的高发区，自1982年起发现戊型肝炎病例，至今先后已有10余次戊肝暴发流行的报道。对我国13个省市、自治区的63个疾病监测点的31,120名1～59岁研究对象进行的血清流行病学调查结果表明，HEV抗体阳性率为17％。HEV带来了沉重的经济负担，成为不可忽视的公共卫生问题。

HEV是一种RNA病毒，只有一个血清型，各地毒株间差异很大，可分为4个基因型。不同基因型致病性、地域分布等存在很大差异。很多学者证实HE是一种新发现的人兽共患传染病，猪是本病重要的贮存宿主。日本等国家已发现多起因食用半生猪肝而发生感染的报道。我们的研究表明，屠宰场、市售猪肝中均能检测出HEV。

目前还没有研制出有效疫苗，细胞培养也非常困难，加之病毒粒子很不稳定，严重制约了对HEV的研究。目前已有酶联免疫吸附试验(ELISA)法抗体检测试剂盒投入市场，可用于血清流行病学调查。但对病毒的检测，只能采用巢氏PCR法检测。现有的PCR检测法不仅费时、费力，且面临假阳性等问题，亟待对本法进行标准化，将其研发为试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用。

本发明所提供的戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒含有4条引物，所述4条引物的核苷酸序列为序列表中序列1至序列4所示。

其中，所述试剂盒还含有2条阳性对照引物，所述阳性对照引物的核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示。

当然，本发明的试剂盒还含有PCR扩增所需要的其他试剂，如dNTP、PCR buffer、Taq酶等。

本发明的另一个目的是提供一种检测戊型肝炎病毒的方法，是以待测样品的cDNA为模板，以序列表中序列1和序列表中序列2所示的DNA分子为引物进行第一轮PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；以所述第一轮PCR扩增产物为模板，以序列表中序列3和序列表中序列4所示的DNA分子为引物进行第二论PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物；琼脂糖凝胶电泳检测所述第二轮PCR扩增产物，100-150bp之间有条带为戊型肝炎病毒阳性。

所述方法中还包括以序列表中序列5和序列6的DNA分子为引物，以待测样品的cDNA为模板，进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR扩增产物，150-200bp之间有条带。

本发明的戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒中含有的引物是根据HEV保守区域设计简并引物能检测出所有已报道的毒株。特异性、灵敏度均高于其它方法，同时扩增片段仅130bp左右，减少了扩增时间。以扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为阳性对照，防止扩增失败和假阳性的出现。本发明的检测戊型肝炎病毒的方法实现了对肝脏中病毒的快速检测，6小时左右即可获得结果进一步结合测序，可对HEV基因型、亚型进行鉴定。本发明的戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒可用于临床诊断、监测，科研及大规模的流行病学调查。

附图说明

图1为PCR鉴定戊型肝炎病毒结果。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

本发明通过对Genebank中登录HEV序进行比对，从保守区设计2对简并引物，建立RT巢氏PCR方法；以猪肝脏为样品，Trizol法提取总RNA，经逆转录后获得cDNA，以戊型肝炎病毒特异引物进行PCR扩增；以持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因表达产物为检测对象设阳性对照，另设阴性对照。

实施例1、戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒检测戊型肝炎病毒

新鲜的肝脏样品加入液氮研磨，用1.5ml离心管分装后-80℃冻存。取1管研磨的肝组织，加入1ml Trizol，轻轻混匀，裂解5min。加入0.2ml的氯仿，盖上离心管盖，剧烈混匀10秒，静止5min，4℃，12000rpm离心10min。将水相转移到新的1.5ml离心管，加入0.5ml异丙醇，室温放置5min，4℃，12000rpm离心10min沉淀RNA。弃去上清，加入1ml 75％的乙醇摇匀，4℃，1000rpm离心5min。倾去乙醇，室温放置15min挥发乙醇，加30μlDEPC处理水溶解，得到总RNA。