[发明专利]一种检测传染病病原体的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，特别是涉及检测传染病病原体的方法及试剂盒。

背景技术

在传染病流行的初期，准确、快速、便捷地传染病的病原体进行检测，是控制传染病流行的关键。虽然国内和国际上已经建立了传染病的监测系统，但是现有的检测手段各有局限性。血清学检查利用相应的抗体与抗原结合检测到病原体，此方法诊断快速，简单、易于操作，但必须制备出针对该病原体的抗体后才能够得到检测，尤其是在还没有抗体来源的情况下不适用于传染病的早期诊断。

病原体分离法是通过直接对病原体进行分离培养，检测鉴定病原体。此方法灵敏度高、特异性强，但操作复杂、费时(至少要花费一周时间)，对实验室生物安全条件要求非常高，所以很难在疫情发生现场采用，而且不是所有的病原体都能通过病原体分离法获得。

核酸检测技术操作简便，反应快速，尤其是近年来发展的实时荧光定量PCR(Real time PCR)，灵敏度高，且能够监控整个反应进程，但一直存在DNA污染造成的假阳性率高的问题，而且由于其临界值不明显，因此检测结果灰区较宽，无法标准化，而且由于仪器要求高，投入大，对操作人员要求高，需要进行专业技能培训，还限制了多重检测的应用。同时该方法对于病原体含量极低的样本仍然无法检测。

NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA，依赖核酸序列的扩增技术)是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术的反应体系包括反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖核酸聚合酶和两条特别设计的寡核苷酸引物，其上游引物3′末端与模板的3′末端互补，5’末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子序列，下游引物3′末端序列与模板的5′末端序列一致，5’末端含有与捕获探针互补的序列。在扩增起始阶段，上游引物与正义RNA模板结合后，在反转录酶的作用下合成与靶标RNA互补的反义cDNA，而原来的的RNA模板则被RnaseH降解。接着下游引物与cDNA杂交，在反转录酶的DNA聚合酶特性的作用下合成双链cDNA，即对应靶标RNA的双链cDNA拷贝。由于双链cDNA一端包含有T7RNA polymerase的启动子序列，从而诱导了RNA聚合酶的活性，合成大量的与靶标序列互补的反义RNA链。如此循环反复，RNA拷贝数被不断放大。同时由于双链cDNA的另一末端还整合了与捕获探针互补的序列，因此所产生的互补RNA又能特异的结合捕获探针，以用于下一步的检测。

酶连接寡核苷酸捕获技术原理是NASBA扩增产物首先特异性地与捕获探针一端结合，后者的另一端能固定连接在微孔板上，然后加入病原体特异性检测探针及反应底物，检测产生的比色信号，这一检测读数与RNA的扩增产物量成正比，以此来检测NASBA扩增产物总量，判断病毒模板的感染情况。此方法操作简单，特异性强，适用于大量样品的快速检测。

近年来出现的传染病如SARS、禽流感等呼吸道传染病，传播速度快、病死率高、对社会危害极大。禽流感病毒、SARS冠状病毒、汉坦病毒、耶氏鼠疫菌、炭疽杆菌引起的呼吸道传染病共同症状为发烧、头痛，亦可伴有恶心、呕吐，这些病原体致病性高并且难以区分，极易延误诊断和治疗的最佳时机。目前尚未见报道同时能检测及鉴别上述六种传染病病原体的检测方法，也没有相应的临床检测试剂盒上市。

发明内容

本发明目的是克服现有技术不能同时检测多种传染病病原体的缺陷，提供一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，所述传染病病原体包括禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、SARS冠状病毒、汉坦病毒和耶氏鼠疫菌，包括：

(i)扩增生物样品的核酸片段，所述核酸片段为以下的一种或一种以上的组合：

禽流感病毒H5亚型HA基因如SEQ ID NO.1所示的核酸片段；

禽流感病毒H7亚型HA基因如SEQ ID NO.2所示的核酸片段；

SARS冠状病毒的核衣壳蛋白基因如SEQ ID NO.3所示的核酸片段；

汉坦病毒核衣壳蛋白基因如SEQ ID NO.4所示的核酸片段；

耶氏鼠疫菌pPCP1基因如SEQ ID NO.5所示的核酸片段；

炭疽杆菌假定蛋白基因如SEQ ID NO.6所示的核酸片段；

(ii)用探针进行检测，所述探针与步骤(i)扩增产物中的一种特异性杂交。

本发明的一个优选实施方案是所述步骤(i)利用NASBA技术扩增样品的核酸片段。NASBA优选的运行条件为41℃～45℃温育90～150分钟。