[发明专利]一种检测土拉菌的基因液相芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测土拉菌(Francisella tularensis，F.t)的基因液相芯片及 其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。

背景技术

液相芯片检测是近几年发展起来的新兴技术，具有快速、特异、敏 感的特点。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的 微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜 色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究 目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据 不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。

土拉菌(Francisella tularensis，F.t)为需氧球杆状小杆菌(0.2μm×0.2～ 0.7μm)，细胞单生，极其多形态，无芽孢，无动力；革兰氏染色阴性， 染色时不易着色。本菌在普通培养基上不生长，在适当的固体培养基(如 含1％血红蛋白的胱氨酸血琼脂培养基)上培养2～4d可形成光滑、凸起的 灰白色菌落。血褪色并可以变成绿色。在石蕊牛奶中弱生长，可产弱酸。 最适生长温度37℃，致死温度56℃10分钟。在低温下能很好的存活。

菌培养是诊断土拉弗氏菌病的金标准，根据该菌37℃生长缓慢、28 ℃几乎不生长的特性可与28℃较快生长的鼠疫杆菌、新凶手弗氏菌区别 开来，但因其容易引起实验室感染，无法作为常规操作。而试管凝集法 的敏感性和特异性都很高。分子生物学方法主要有PCR、实时荧光PCR 等。

发明内容

本发明涉及一种改进的基因液相芯片及其制备方法，该基因液相芯 片可以用于病原体土拉菌的检测。本发明还涉及利用所述的基因液相芯 片进行检测的方法。

经过深入和大量的研究和实验，本发明以土拉菌fopA基因特异性序 列为靶序列，建立了土拉菌液相芯片和检测方法，为该菌的检测提供一 条可行的途径。

本发明所述的基因液相芯片包括：微球、捕获探针、引物、PCR反 应体系、链亲和素-藻红蛋白，该基因液相芯片可检测土拉菌。

本发明还涉及上述可检测土拉菌的基因液相芯片，该芯片包括：荧 光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白， 其中

本发明的PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚 合酶。

本发明的引物包括：

其中，下游引物是5’生物素标记的Ft-R。

具体例如是Ft-R：5’-生物素-GCTGTAGTCGCACCATTATCCT

本发明的捕获探针，所述的捕获探针具有特异性：

  探针   名称   探针靶位   探针序列(5’-3’)   Ft   土拉菌fdX基因的989-1012   bp   TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG

上面所述探针在合成时在5’端进行氨基修饰，并且连接15-20个T 或连接C12作为间隔链，然后将探针与所选的编码微球进行偶联。

本发明的微球，一般选择荧光编码的微球，例如来源于Luminex或 其他代理公司的任何编号的微球，特异性探针与荧光编码微球偶联形成 检测微球，由此构成检测芯片。

本发明的链亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-R-phycoerythrin，SA-PE) 为一种荧光蛋白，能被液相芯片检测系统中的绿色激光激发发光，由此 可以进行定性或定量检测。