[发明专利]检测融合基因Bcl2-IgH重排的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测融合基因Bcl2-IgH重排的试剂盒，特别是涉及以荧光定量聚合酶链反应技术检测临床样品中融合基因Bcl2-IgH重排的试剂盒。

背景技术

融合基因Bcl2-IgH是t(14:18)(q32:q21)染色体易位产物，其引发位于18号染色体q21区的Bcl2原癌基因并置到IgH序列14q32上，见于非霍奇金淋巴瘤(NHL)。Bcl2基因全长230kb，包含三个外显子，60％-70％的重排发生于Bcl2基因序列第三个外显子3’端150bp的非翻译区，称主要断裂点决定区(Major breakpoint region，MBR)；20％-30％发生于Bcl2基因序列第三个外显子3’端25kb处，称次要断裂点决定区(Minor cluster region，MCR)。其余的断裂点散在分布在Bcl2基因序列上。Bcl2-IgH的重排，导致Bcl2-IgH mRNA水平上调。随后IgH增强子序列超越了正常的Bcl2基因调控过程，导致Bcl2基因在滤泡中心B细胞的高表达，从而抑制B细胞凋亡，使B细胞持续增殖，引发肿瘤。在NHL中，57％未检测到重排，病人亦没有复发，25％在临床复发前检测到重排。14％在骨髓细胞中检测到重排，骨髓移植后未能再检测到，因而不需要进一步化疗。未检测到重排的病人无病生存期较检测到者明显增加(P＜0.00001)，后者比前者的复发危险要大48倍。

NHL的复发仍是主要问题，检测微小残留病灶对于判定治疗效果，预后复发以及制定进一步治疗方案均有重要价值。Bcl2-IgH基因重排是NHL最重要的分子生物学特征，检测该基因对NHL的诊断、鉴别诊断及预后具有重要意义。目前检测融合基因Bcl2-IgH重组的方法主要为实时荧光定量PCR技术。

实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的(终点检测)PCR技术相比，实时定量监测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。

实时荧光PCR技术是在聚合酶链反应(PCR)体系中加入荧光标记探针，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。通过对扩增曲线以及循环阈值(Ct)的分析，能够对检测样品进行定性和定量分析。实时荧光PCR将DNA扩增与检测过程融合为一体，动态检测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程，大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便。由于实时荧光PCR采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此的造成的假阳性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology..Nucleic Acids Res.20025；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitativePCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion in Biotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。

美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV-1、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测试剂盒。同样，中国目的也已批准了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV-1和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。在欧盟，一些基于实时荧光PCR检测融合基因的检测试剂盒已经通过CE认证。因此，开发一种能够检测融合基因Bcl2-IgH重排的实时荧光PCR试剂盒，对NHL的诊断，治疗检测和预后具有重要意义。