[发明专利]一种耐热角质酶-CBD的制备及其在棉纤维精练中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐热角质酶-CBD基因的制备，及其在棉纤维精练中的应用，属于酶基因工程和酶工程领域。

背景技术

在棉织物精练过程中，为了使棉纤维获得优良的润湿性和白度，需要去除严重影响棉织物外观、服用性能和染整加工的角质、棉蜡、果胶质和蛋白质等各种伴生物。目前国内一直采用传统的强碱高温处理方法，它存在许多不足之处，流程复杂冗长，设备庞大、纤维损伤大，水耗和能耗大，产生大量污水，对生态环境极为不利等。随着社会对纺织品和环境的环保问题日益重视，酶用于纺织中，易于生物降解，不会污染环境与纺织品。用酶对棉织物进行前处理是国内外公认的21世纪的环保型染整技术。今后对纺织专用酶制剂的需求必将逐渐增大，推广应用前景广阔。

角质酶可分解棉纤维表面的角质，并将附着的脂质等杂质一同从棉纤维表面除去，同时对棉籽壳也有一定的降解作用，可提高原棉的润湿性；与果胶裂解酶具有较好的协同效应，能更好地去除角质层、果胶层，保证织物的良好纺织性能；与其他纺织酶制剂复合使用可实现纺织的绿色加工。角质酶在纺织行业具有较强的应用潜力。

纤维素结合域(cellulose-binding domain，CBD)在结构上和功能上都是纤维素酶独立的结构域，能够提高底物在酶周边的浓度或破坏底物多糖结构进而增强了酶催化能力。CBD作为最普遍的结构组成已有大量数据显示与酶和纤维素的有效结合密切相关，尤其对结晶纤维素的降解是必须的。CBD对于提高酶与纤维的可及度，增强纤维素酶解效率，揭示纤维素酶解过程具有重要意义。将CBD与精练用酶(如角质酶)融合可以增加酶对棉纤维的结合能力，从而更好地水解棉纤维表面杂质，这种提高角质酶催化效率的分子改造策略目前国内外未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种耐热的角质酶-CBD，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的耐热角质酶-CBD的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明的再一个目的是提供包含本发明基因的表达载体。

本发明的又一个目的是提供包含本发明表达载体的宿主细胞。

本发明的技术方案：一种耐热角质酶-纤维素结合域融合酶，缩写为耐热角质酶-CBD，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的耐热角质酶-CBD的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

所述的耐热角质酶-CBD基因的表达方法：以pET20b-Tfu_0883质粒DNA及嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11总DNA为模板，设计引物分别PCR得到编码角质酶Tfu_0883的基因及纤维素酶Tfu_1074中CBD的基因，再通过重叠PCR获得编码角质酶-CBD的融合基因SEQ ID NO：1。角质酶-CBD基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现耐热角质酶-CBD基因的高效表达；

(1)Thermobifida fusca WSH03-11总DNA的提取：

Thermobifida fusca WSH03-11菌株(该菌株巳在【化工进展】2006年第25卷第5期公开)，在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中50℃培养2天，取3mL菌液12000rpm离心收集菌体，按照北京博大泰克细菌基因组DNA提取试剂盒方法提取Thermobifida fusca WSH03-11总DNA；

(2)耐热角质酶-CBD编码基因的克隆：

根据NCBI上登录的Tfu_0883及Tfu_1074的基因序列分别设计两对引物P1、P2和P3、P4。下划线为酶切位点NcoI和EcoRI，

P1：5’-GGAATACCATATGTCCATGGCCAACCCCTACGAGCGCGG-3’

P2：5’-CGCGGCGATCGCCATGAACGGGCAGGTGGA-3’

P3：5’-TCCACCTGCCCGTTCATGGCGATCGCCGCG-3’

P4：5’-CATCTCGAGAGAATTCGGGCAGGTAAGGGTCGGAACAG-3’