[发明专利]一种耐热角质酶-CBD的制备及其在棉纤维精练中的应用

权利要求书

1.一种耐热角质酶-纤维素结合域融合酶，缩写为耐热角质酶-CBD，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

2.一种编码权利要求1所述的耐热角质酶-CBD的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种权利要求2所述的耐热角质酶-CBD基因的表达方法，其特征是以pET20b-Tfu_0883质粒DNA及嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11总DNA为模板，设计引物分别PCR得到编码角质酶Tfu_0883基因及纤维素酶Tfu_1074中CBD的基因，再通过重叠PCR获得编码耐热角质酶-CBD的融合基因SEQ ID NO：1，以pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现了耐热角质酶-CBD基因的高效表达；步骤为：

(1)Thermobifida fusca WSH03-11总DNA的提取：

Thermobifida fusca WSH03-11菌株在LB液体培养基中50℃培养2天，取3mL菌液12000rpm离心收集菌体，按照北京博大泰克细菌基因组DNA提取试剂盒方法提取Thermobifida fusca WSH03-11总DNA；

(2)耐热角质酶-CBD编码基因的克隆：

根据NCBI上登录的Tfu_0883及Tfu_1074的基因序列分别设计两对引物P1、P2和P3、P4，下划线为酶切位点NcoI和EcoRI，

P1：5’-GGAATACCATATGTCCATGGCCAACCCCTACGAGCGCGG-3’

P2：5’-CGCGGCGATCGCCATGAACGGGCAGGTGGA-3’

P3：5’-TCCACCTGCCCGTTCATGGCGATCGCCGCG-3’

P4：5’-CATCTCGAGAGAATTCGGGCAGGTAAGGGTCGGAACAG-3’

以pET20b-Tfu_0883质粒DNA为模板，以P1、P2为引物，PCR扩增角质酶的基因；以Thermobifida fusca WSH03-11总DNA为模版，以P3、P4为引物，PCR扩增纤维素酶CBD的基因；PCR反应在50μL体系中参照TaKaRa Ex Taq^TM试剂盒的方法进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环后，再于72℃延伸10min；分别扩增得到780bp与381bp的PCR片段，割胶回收；然后再以角质酶基因与CBD基因PCR割胶回收片断为模板，以P1、P4为引物，再进行PCR反应；扩增得到1161bp的PCR片段，割胶回收；回收片段与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板；经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，命名为Tfu_0883-CBD/pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定；

(3)耐热角质酶-CBD基因在大肠杆菌表达载体上的构建： 

用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒与耐热角质酶-CBD基因进行NcoI和EcoRI双酶切，酶切产物割胶回收后，用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，37℃培养过夜，挑选转化子在含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中进行液体培养，然后提取质粒，得富集的Tfu_ 0883-CBD/pET20b(+)质粒；

(4)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：

将质粒Tfu_0883-CBD/pET20b(+)转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，再在含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子重组菌Tfu_0883-CBD/pET20b(+)/E.coli BL21(DE3)在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基，25℃培养48h时产酶达40U/mL；

(5)耐热角质酶-CBD的纯化：

将步骤(4)所得耐热角质酶-CBD发酵液于4℃、10000rpm离心30min除菌体；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心30min，沉淀用含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑，pH 7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，用含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、0-500mM咪唑，pH 7.4的缓冲液线性梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含角质酶酶活的洗脱液；活力组分用30000道尔顿膜离心浓缩，得纯化耐热角质酶-CBD酶制品。

4.一种权利要求1所述耐热角质酶-CBD的应用，其特征是用于棉纤维的精练；耐热角质酶-CBD具有角质酶活性，最适温度为50℃，最适pH 8，在50℃下保温50h，酶活仍达50％以上，耐热角质酶-CBD对棉纤维的吸附率为50％，6h达到反应平衡，生成180μmol脂肪酸；

(1)耐热角质酶-CBD对棉纤维的吸附效果：

试样为10mL反应体系，其中分别加入1mL耐热角质酶-CBD的酶液、酶活力100U/mL，1mL果胶酶液、酶活力100U/mL，8mL pH 8.0的25mM磷酸钾缓冲液，0.5g原棉纤维和50μL渗透剂TX-10；对照样与不加原棉纤维的上述试样其它条件一致；在室温下反应，定时取样；取出的样液经离心3min后按照测定酶活的方法测上清液中酶活；被吸附的酶量为对照样溶液中的酶活减去上清液中的酶活；

(2)耐热角质酶-CBD对棉纤维的精练效果：

试样为10mL反应体系，其中加入0.5g原棉纤维，8mL pH 8.0的25mM磷酸钾缓冲液，1mL耐热角质酶-CBD酶液、酶活力100U/mL，1mL果胶酶液、酶活力100U/mL和50μL渗透剂TX-10，在50℃保温，不同时间取样，用0.02mol/LNaOH溶液滴定生成的脂肪酸。