[发明专利]亚洲梨火疫病菌的检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明亚洲梨火疫病菌(Erwinia pyrifoliae)的检测试剂盒及其检测方法， 属于生物技术领域。专用于海关进出境亚洲梨所带亚洲梨火疫病菌的高灵敏度快 速检测，同时可用于田间亚洲梨火疫的早期诊断和病菌的监测。

(二)背景技术

自1995年起，在韩国的Chuncheon地区果园的亚洲梨(Pyrus pyrifoliae)上发 现一种与梨火疫病(Erwinia amylovora)十分相似的病害。随后的研究表明该病 与梨火疫病十分相似但又不完全相同。该菌主要侵染亚洲梨和部分西洋梨(Pyrus communis)品种，对苹果无致病力。最终在德国所做的分子生物学鉴定进一步将 此病鉴定为一个新种：亚洲梨火疫病菌(Erwinia pyrifoliae)。我国没有发生此病 害，是我国规定的检疫性有害生物。该病主要侵染梨树花序和嫩枝，引起花腐 和枝枯，症状与Erwinia amylovora引起的症状十分相似。

亚洲梨火疫病菌对于我国，目前最有可能亦最危险的传播途径是通过带菌接 穗、苗木和果实的传带，所以在海关加强检验检疫是十分必要的。检测技术先 进、可靠，外来有害生物传入的风险就可以降低。目前国内外农产品及植物种苗 交易十分频繁，有必要建立一种准确率和灵敏度均高的快速检测方法来检测亚洲 梨火疫病菌，尤其是无症状的植物材料的检测。由于该病是我国的一类检疫性病 害，因此在我国检疫是主要的控制此病害的手段，严格限制或禁止从发生此病害 的国家和地区进口梨和苗木等，从其它国家进口的种子必须进行有关的检验。目 前亚洲梨火疫具体的检测手段主要是传统的检测技术和分子检测技术。传统的检 测技术包括利用半选择性培养基分离和鉴定病菌、免疫学检测方法、致病性测定 及过敏反应测定、生理生化反应测试等。这些方法往往需耗费较长时间并且灵敏 度和准确性不高，因此常规的检测方法难以适应检疫的需求。

近年来，采用PCR扩增病原菌的致病性基因、未知的DNA片段、质粒DNA和 rDNA转录间隔区(ITS)等进行病原菌鉴定、检测及病害诊断为国际上广泛使 用。Bereswill等人(1992)利用梨火疫病菌的pEA29质粒上0.9kb的pstI片段对梨火 疫病菌进行特异性鉴定，特异性扩增梨火疫病菌菌体，检测灵敏度可达50个菌体 细胞，并在6小时内可得结果。Bereswill等人(1995)利用梨火疫病菌的ams基因 设计了一对引物，对梨火疫病菌进行特异性检测，专化性极好，由于ams基因的 拷贝数很低，因此灵敏度只有扩增pEA29质粒PCR技术的1/10(500细胞)。 Merighi等(2000)利用PCR-ELISA技术对梨火疫病进行了检测，检测人工接种 的梨枝条，灵敏度达4×10²cfu/g。但是这些报道都是针对Erwinia amylovora设计 的引物，无法将亚洲梨火疫区分开来。

随着近年来我国口岸对亚洲梨及种苗进口的增多，该病菌从疫区进入我国的 机会亦增多，但我国口岸缺乏必要的对该病菌的检测方法。病害防治、预测预报 及植物检疫需要有准确快速的病菌检测方法，尤其是需要我国拥有自主知识产权 的检测方法，从而可以将之投入到商业生产和应用中，目前在这一领域还没有一 种既灵敏特异又快速的亚洲梨火疫检测方法的报道。此项发明满足了这些需求。

参考文献

Bereswill，S.，Pahl，A.，Bellemann，P.，Zeller，W.& Geider，K.(1992).Sensitive and species-specific detection of Erwinia amylovora by polymerase chain reaction analysis.Appl Environ Microbiol 58，3522- 3526；

Bereswill，S.，Bugert，P.，Bruchmüller，I，Geider，K.(1995)Identification of the fire blight pathogen， Erwinia amylovora by PCR assays with chromosomal DNA.Applied and environmental microbiology 61 (7)，2636-2642；