[发明专利]金黄色葡萄球菌肠毒素C3制备、制剂、用量及其用途

权利要求书

1.一种金黄色葡萄球菌肠毒素C3(Staphylococcal Enterotoxin C3，SEC3)的制备方法、纯化方法、制剂及其在制备肿瘤、病毒及调节机体免疫药物中的应用，其特征在于：采用标准菌株FRI～S6或FRI～1230，其中以FRI～1230为首选，经过改良后的培育基发酵，分离SEC3成分，制成注射剂、口服制剂，制成的制剂用于肿瘤、病毒及调节机体免疫药物，其指标成分为SEC3。

2.权利要求1所述的SEC3制剂，其特征在于：SEC3单、复方普通注射剂、输液制剂；先进的SEC3靶向等制剂(注射、口服、外用)；SEC3单、复方制成的口服液、胶囊、片剂、微丸等口服制剂。

3.如权利要求2所述的SEC3制剂，其特征在于：SEC3单、复方经肌肉、血液给药的普通制剂临床用量有效剂量范围是大于3ng/天；SEC3靶向、融合等技术制成单、复方经肌肉、血液给药的先进制剂临床用量有效剂量范围是大于3ng/天；SEC3单、复方制成的口服液、胶囊、片剂、微丸等口服制剂，临床用量有效剂量范围是大于800ng/天。

4.如权利要求3所述的SEC3制剂，其特征在于：肿瘤方面：联合放化疗，起到增效减毒防止血象异常的作用；预防和治疗因放化疗引起的白细胞减少或异常；对于手术后肿瘤患者，还能预防肿瘤的复发及转移；在肿瘤方面还具有直接抑制、清除肿瘤细胞的作用；本发明的研究，还包括肿瘤领域其他未在本文描述的疾病范围及需要免疫治疗的。病毒方面：用于病毒性肝病、艾滋病、疱疹、流感等治疗，本发明的研究，还包括病毒领域其他未在本文描述的疾病范围。免疫调节方面：用于红斑狼疮、银屑病等免疫性疾病，还包括免疫领域其他未在本文描述的需要免疫治疗的疾病。

5.权利要求1所述的SEC3成分制备方法，其特征在于：

(1).按照常规方法，打开金黄色葡萄球菌产肠毒素标准菌株FRI～S6或FRI～1230，其中以FRI～1230为首选。

(2).把标准菌株分离于琼脂平板和血平板上，经孵育选取典型菌落；

(3).选取典型菌落，接种于复壮培养基中，20℃～45℃复壮培养10～22小时，进一步分离，分离与琼脂平板和血平板上；

(4).选取步骤(3)分离的典型菌落，接种于种子培养基中，20℃～45℃摇瓶进行培养10～22小时；

(5).把步骤(4)中的菌落按照1.0％～10.0％(V/V)接种于20℃～45℃生产培养基中，于20℃～45℃温度下，培养24～72小时；

(6).取步骤(5)培养液，离心除菌，过滤，取上清液，得SEC3原液；

(7).取步骤(6)SEC3原液经过离子交换、分子筛等，纯化，得高纯度SEC3，SEC3纯度达85％以上。

6.如权利要求5所述的SEC3成分制备用的培养基，其特征在于：

复壮培养基：取新鲜的猪心，去除筋膜等附带组织，洗净，绞碎猪心，绞碎后，加0.5～3.0倍洁净水，60℃～100℃温化0.5～3.0小时，过滤，得滤液，加入总重量0.1～20％蛋白胨，调pH至2.0～7.0，低温静置，后加入0.1％～1.0％的活性炭，煮沸，过滤，滤液调pH至5.0～9.0，静置，再次活性炭吸附，过滤，调pH至3.0～9.0，灭菌，得培养基。

生产培养基：取新鲜的猪心，去除筋膜等附带组织，洗净，绞碎猪心，绞碎后，加一定量的洁净水，60℃～100℃温化5min～180min，冷却，调pH至5.0～9.0，加入总体积1～30％的的胰腺酶，至30℃～65℃酶解，1.0～7.0小时候后，灭活酶活性，过滤，调pH3.0～9.0，加入一定量活性炭吸附后，过滤，调pH3.0～9.0，灭菌，得培养基。

7.如权利要求2所述的SEC3制剂，其制剂特征在：

(1).SEC3口服液的制备：

从权利5中(6)或5中(7)得到的SEC3直接进行配制，添加口服剂的各种辅料制成各种类型的单一成分或复方口服制剂，其中液体口服制剂的pH为4.5～8.0。

(2).SEC3片剂及胶囊的制备：从权利5中(6)或5的(7)得到的SEC3，取淀粉等辅料，喷雾制粒，制得的颗粒灌胶囊，即得SEC3胶囊；制得的颗粒，上压片机，即得SEC3片。

(3).SEC3注射剂的制备：

步骤一、用注射用水配制pH4.5～7.5的PBS，灭菌；

步骤二、取步骤一的PBS，加入从权利5中(7)得到的SEC3；

步骤三、取步骤二的混合液，稀释，定量至每毫升含有SEC35ng、10ng、15ng、20ng等，过滤，除菌，配制成SEC3的注射液；

步骤四、或从权利5中(7)得到的SEC3，稀释，定量至每毫升含有SEC35ng、10ng、15ng、20ng等，过滤，除菌，灌装，上冻干机冻干，制得SEC3冻干制剂。

(4).靶向SEC3的制备：

步骤一、通过重叠PCR技术，连接B3抗体的VH和VL片段，并将PCR产物克隆至原核表达载体；

步骤二、SEC3基因片段经酶切连接亚克隆至上述获得的重组表达载体B3ds-scFv-pET22b，构建包含B3ds-scFv-SEC3-pET22b片段的重组表达载体；

步骤三、经酶切鉴定B3ds-scFv与SEC3两片段连接正确后，转化大肠杆菌，经过不同表达方式进行表达，获得包涵体；

步骤四、将步骤三的包涵体进行变性、复性、复性产物可以通过阳离子柱SP-Sepharose等纯化方法进行初步纯化，获得B3ds-scFv-SEC3融合蛋白。

步骤五、将步骤四的B3ds-scFv-SEC3融合蛋白，采用PBS等制成B3ds-scFv-SEC3融合蛋白注射液或注射用冻干粉。